前言
衰老会导致免疫功能进行性失调，几乎影响免疫系统的所有组成部分，也将增加对多种疾病的易感性。然而，老年免疫系统成分组织特异性变化以及它们的保守性仍然知之甚少。
2021年01月，美国华盛顿大学医学院研究团队在Immunity期刊（IF：43.474）发表了题为的研究成果，采用单细胞转录组测序 (scRNA-seq) ， 单细胞免疫组库测序 (TCR, BCR)，质谱流式细胞术 (CyTOF)单细胞蛋白质组学， 表位转录组测序 CITE-seq测序等研究方法，全面描述了免疫衰老的细胞景观，并发现了一个新的衰老细胞标志——表达CD8 的克隆颗粒酶K (GZMK) 并在物种之间保守的T细胞。GZMK CD8 T 细胞的一个独特亚群在在衰老环境中驱动产生，并且可以通过增加 GZMK 的分泌而促成免疫衰老表型。这一系列工作提示GZMK 细胞有望成为解决年龄相关免疫系统功能障碍的潜在靶细胞。
研究背景
为了揭示免疫系统中与年龄相关的复杂变化，文章结合使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和单细胞免疫组库测序（TCR/BCR）对免疫细胞进行测序，然后应用流式细胞术进行广泛的功能验证。利用流式细胞术、质谱流式(CyTOF) 单细胞蛋白质组学技术，对人类血细胞亚群进行详细分析，将在小鼠中的发现在人样本中得到验证。作者全面描述了免疫衰老的细胞景观，并发现了一个新的衰老细胞标志——表达 CD8 和GZMK 的T 细胞群。并通过机制验证，表明GZMK CD8 T 细胞在衰老进程中发育产生，具备通过增加 GZMK分泌而促成炎症表型的功能。文章研究成果将为缓解免疫衰老，改善免疫功能提供有力的帮助。
研究思路
研究结果
1、免疫系统衰老的共同变化以及器官特异性变化
文章首先分析了年轻（3-6 个月）和老年（17-24 个月）C57BL/6J 小鼠的免疫系统概况。从年轻和老年小鼠的四个器官：免疫器官（脾脏）、外周免疫区室（腹膜腔）、呼吸器官（肺）和代谢活跃器官（肝脏）分选CD45免疫细胞，并进行了 scRNA-、TCR- 和 BCR-seq 测序（图1A）。数据聚类揭示了各个器官中的主要免疫细胞群在衰老过程中发生的一些变化（图 1 B-1D )。最引人注目的观察是 GZMK CD8 T 细胞在所有四个器官中的积累。器官特异性变化包括与年龄相关的自然杀伤 (NK) 细胞和幼稚 T (Tn) 细胞减少；脾脏和腹膜 B 细胞的改变；腹膜、肺和肝中巨噬细胞亚群的变化；脾调节性 T (Treg) 细胞增加（图 1B -1D）。
图1 | 老年小鼠免疫系统单细胞图谱
a)概述免疫系统的单细胞分析；
b)带注释的细胞簇；
c)细胞分布 ；
d)与年龄相关的簇比例的倍数变；
2、先天免疫系统衰老的器官特异性变化
作者对年轻和老年小鼠进行了流式细胞术分析，以验证骨髓和先天淋巴细胞的年龄相关变化（图2A 和 2B）。这些改变包括腹腔巨噬细胞数量的显著减少（图 2 C）和肺泡巨噬细胞的减少（图 2 D)。这一过程被老年小鼠肺间质巨噬细胞 (IMΦ) 和肝巨噬细胞中单核细胞 (CCR2 和 CX3RC1) 的增加所抵消（图 2 D-2F）。与 scRNA-seq 数据一致，衰老小鼠的多个器官中 NK 细胞的比例降低（图 2 G）。
衰老改变增加了脾脏和腹膜Zbtb32 B 细胞亚群（图 2 H-2J）。随着年龄的增长，腹膜 B-1 细胞（第 3 组）和脾脏Zbtb32 B 细胞（第 7 组）的两个 B 细胞亚群显示出在老年小鼠中的克隆性增加（图 2 K）。为了评估这种表型是否与克隆反应相关，作者分析了 CD4T 细胞中配对的 TCRα/TCRβ 库。作者发现，与研究组织内的年轻小鼠相比，老年小鼠的 CD4 TCR 多样性没有改变（图 2 P)。此外，作者发现年轻和老年小鼠的组织之间几乎没有共享 CD4 TCR 克隆（图 2 P 和 2Q）。这些结果表明，衰老过程中各种器官中促炎 CD4 T 细胞的积累与其 TCR 多样性的深刻改变无关。
图2 | 小鼠免疫细胞群的年龄相关变化
a)腹腔MΦ 种群的比例（流式细胞术）
b)肺MΦ 种群的比例（流式细胞术）
c)肝脏MΦ 种群的比例（流式细胞术）
d)肝脏MΦ 种群的比例（流式细胞术）
e)脾脏中 ABC 的比例（流式细胞术）
除此之外，作者还研究了代谢分类器中的所有奇数链脂肪酸（OCFAs），并对它们进行了斯皮尔曼等级相关系数分析。结果发现LysoPC（17：0/0：0）与SM（d18：1/15：0或d16：1/17：0）和LysoPC（15：0/0：0）呈正相关，而PC（15：0/24：0）与其他OCFA呈负相关。
3、GZMK CD8 T 细胞在多个器官中表现为衰竭标志物和年龄相关性标志物
接下来，作者关注与年龄相关的 CD8 T 细胞室重塑。CD8 Tn 细胞的比例下降，而 PD-1 CD8 T 细胞的比例增加 。然而，与 CD4 T 细胞相比，PD-1 CD8 T细胞标志着独特细胞亚群的出现（图 3A -3C）。这些与年龄相关的 (Taa) CD8细胞的特征在是Gzmk的表达，这也是最特异性的标志物之一。
CD8 Taa 细胞不同于传统的 Tem 细胞，其特征在于共表达转录因子 TOX 和检查点分子，包括 PD-1（图 3 C）。单细胞RNA测序（scRNA-seq ）数据证明了 Taa 细胞特异性Gzmk和Pdcd1转录物共表达，证实 PD-1和 TOX可用于识别健康小鼠中的这种细胞群。因此，使用 TOX 和 PD-1 作为 CD8 Taa 细胞的标志物，并在流式细胞术中证实，这些细胞的比例在所有研究器官的老年小鼠中增加（图 3D-3E）。
接下来，作者评估了 CD8 T 细胞亚群中的 TCR 库。与 CD4 T 细胞数据相反，作者观察到老年 CD8 T 细胞的克隆性增加，这些细胞集中在 CD8 Taa 细胞簇内，但不在 Tem 亚群内（图 3 F-3H）。值得注意的是，在老年小鼠的不同器官中同时发现了相同的 TCR 克隆，但在年轻小鼠中却没有（图3G）。总之，这些结果表明，CD8 Taa 细胞经历了克隆扩增，并在老年小鼠的各种器官中积累了常见的 TCR 克隆。
克隆扩增的细胞群的存在通常与 T 细胞活化的历史有关。事实上，CD8 Taa 细胞中 IFNγ 和 CCL5 的表达水平与CD8 Tem 细胞相似（图 3 I）。然而，当体外刺激老年小鼠的总 CD8 T 细胞时，它们分泌的 GZMK 量显著增加。这种表型是由于CD8 Taa 细胞分泌显著更多的 GZMK（图 3 J 和 3K）。这些数据表明，CD8 Taa 细胞具有特定的促炎特征，其特征在于 GZMK 的产生增加。
图3 | 衰老对小鼠 CD8 T 细胞群的影响
4、CD49d 是与组织定位相关的 CD8Taa 细胞的标志物
作者接下来预测了细胞-细胞配体-受体相互作用 （图 4A和 4B）。CD8 Taa 细胞CD49d 的膜蛋白表达水平在组织和血液中均增加了（图 4 C-4E)。在循环中，CD49d 表达对 CD8 Taa 细胞群具有高度特异性，所以作者将 CD49d 的组成型表达确定为这些细胞的关键标志物之一。为了进一步分析和验证，作者专注于 FN1 作为一种原型分子，它可以与免疫细胞表达的细胞外基质成分和 CD49d 结合。在老年小鼠的各种器官中，作者证实 PD-1 CD8 T 细胞可以在富集 FN1 的区域中，它们与 FN1 发生物理相互作用（图 4 F-4G)。这些结果表明 FN1-CD49d 轴可能控制组织归巢和 CD8 Taa 细胞的相互作用。
在成纤维细胞中，Fn1 的表达伴随着衰老相关分泌表型 (SASP) 成分（例如Il6、Ccl2和Cxcl1）在各种器官中的高基础基因表达水平（图4H）。首先，作者发现，在小鼠 3T3 成纤维细胞中，外源添加的 GZMK 显著增强了 IFNγ 诱导的 IL-6 和 CCL5 分泌，炎症因子随着衰老而增加(图 4 I)。作者利用多柔比星模型在 3T3 成纤维细胞中诱导体外衰老和 SASP。这表明即使在没有经典炎性细胞因子的情况下，GZMK 的分泌也有可能加剧 SASP，并表明从 CD8 Taa 细胞释放的 GZMK可能是衰老过程中炎症过程的重要调节因子（图4K）。
图4 | CD49d 在 CD8 Taa 细胞与组织中其他细胞类型之间的串扰中发挥作用
5、CD8 Taa 细胞的发育是由老化环境驱动的
接下来，作者研究了老年小鼠中 CD8 Taa 细胞的积累是否取决于细胞内在机制。为此，作者将同源标记的脾 CD8 T 细胞从年轻小鼠转移到年轻或老年小鼠中（图 5A）。在老年小鼠中，移植后 1 个月足以将循环供体 CD8 T 细胞转化为 TOX + PD-1 +表型，其程度与宿主 CD8 T 细胞相同（图 5 A-5C），CD49d 的表达促进它们在各个器官中的积累（图 5 D-5F)。重要的是，CD8T 细胞转移到年轻宿主中并没有导致这种表型（图 5 A-5F）。
最后，为了研究 CD8 Taa 细胞的生存是否依赖于老年环境，作者将 CD8 T 细胞（包括 TOX PD-1细胞群）从老年小鼠转移到年轻小鼠身上（图 5 G）。CD8 Taa 细胞在年轻的环境中保持了 TOXPD-1表型并保持了升高 CD49d 水平（图 5 G-5K）。结果表明，CD8Taa 细胞的发育和扩增取决于细胞外在的年龄相关因素，并且分化的 CD8Taa 细胞具有稳定的表型，这与归巢到组织的高能力有关。
图5 | CD8Taa 细胞的发育是由老化环境的组成部分驱动的
6、scATAC-Seq 将 EOMES 鉴定为 GZMK CD8 T 细胞的潜在调节剂
为了研究老年免疫细胞群中潜在的基因调控程序，作者对来自年轻和老年小鼠的 17,081 个 CD45脾细胞进行了 scATAC-seq 分析，并确定了 15 个不同的簇（图 6 A）。scATAC-seq 峰值注释表明，这些簇合理匹配 scRNA-seq 数据中识别的主要免疫细胞群的转录特征（图 6 A、6B）。
作者从头基序发现确定了每个簇特异的共有转录因子 (TF) 结合基序（图 5 E）。结果表明 EOMES 和 T-BET 在 CD8 Taa 细胞发育中的不同作用。同样，作者跟进了作为 CD4T 细胞的年龄相关特征出现的 AP-1 基序富集（图 6 E），并证实了年龄相关 Treg 细胞中 BATF 在 RNA 和蛋白质水平上的表达升高（图 5 C 和 5G）。
这些结果突出了 CD8Taa 和 Tex 细胞之间的相似性，显示了这些细胞群之间的转录和表观遗传平行性，但也表明 CD8Taa 细胞在老年小鼠中存在明显的表观遗传调控。
图6 | 通路富集分析显示了肿瘤和基质的不同代谢特征
7、GZMK CD8 T 细胞是人类炎症的标志
鉴于 GZMK 作为衰老小鼠 CD8 T 细胞的关键标志物的出现，作者首先分析了来自非肥胖健康年轻人和老年人的 CD8T 细胞循环群（图 7A）。对常规 CD8 T 细胞的分析显示，CD8 Tn 细胞比例显著降低，Tcm 和 Tem 细胞群增加，但老年人的 Temra 细胞群没有显著变化（图 7 E 和 7F）。鉴于作者观察到 GZMK 和 GZMB 主要定位于不同的细胞，这表明 Tem 细胞室可能含有不同的亚群。
使用流式细胞术，作者验证了 CD57 和 CD28可以定义了 CD8 Tem 细胞内的两个不同子集（图 7 G）。数据证明了与年龄相关的具有高 GZMK 表达水平的 T 细胞亚群在老年人的 CD8 T 细胞内扩增，而在健康个体中，两个表达 GZMB 的亚群并没有明显改变。
在 CyTOF 和流式细胞仪分析下，作者利用 CITE-seq 数据确定 Tem-k 亚群中表达高水平的 CD45RO 和低水平的 CD57的部分（图 7 L）。表明 Tem-k 簇主要对应于 CD57 - Tem 细胞。对 CD8细胞群的进一步研究使作者找到与其分化程序相关的 TF（图 7 O）。结果表明，GZMK CD8 Tem-k 和 Tcm 细胞具有不同的表观遗传景观，并且与小鼠中的 Taa 细胞相似，可能依赖于 T-BET 和 EOMES 保持转录调控之间的平衡。
图7 | 通路富集分析显示了肿瘤和基质的不同代谢特征
相关讨论
作者对免疫细胞群中与年龄相关的变化进行了广泛的描述。作者的数据揭示了衰老的免疫系统中器官特异性变化，并强调克隆性 GZMK CD8 Taa 细胞的出现是免疫衰老最显著的细胞标志之一。在高龄小鼠中，循环中的所有 CD8 T 细胞中近一半获得 GZMK Taa 表型。这种细胞群对衰老生理学意义重大。
作者表明，CD8 Taa 细胞的发育依赖于衰老环境。一旦分化成 Taa 表型，这些细胞就会上调 CD49d 表达并获得有效组织归巢的能力。作者将克隆 GZMK CD8Taa 细胞鉴定为健康老年动物中真正不同的亚群，并强调它们通过 GZMK 分泌对免疫衰老的潜在贡献。
scATAC-seq 分析表明 T-BOX 调节程序可能支持 CD8T 细胞转变为 GZMK +表型。作者发现克隆 GZMK CD8 Tem-k 细胞亚群随着人类年龄的增长而增加。这些细胞具有独特的表观遗传景观，表明 T-BOX 转录因子参与了它们的发育。然而，人类 CD8T 细胞也包括一个独特的 GZMB Tem-b 细胞亚群，它在小鼠中没有直接的等价物。这种差异可能与小鼠在无病原体条件下衰老有关，而人类的免疫系统受到多种病原体暴露的影响。
总之，作者的结果将 GZMK CD8 T 细胞确定为免疫衰老的标志，并强调这些细胞以及 GZMK 本身是解决与年龄相关的免疫系统功能障碍的潜在靶标。
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该团队为了揭示免疫系统中与年龄相关的复杂变化，综合利用了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和单细胞免疫组库 (TCR, BCR)测序。在机制探索上，用流式细胞术、质谱流式细胞术 (CyTOF) 以及CITE-seq)技术对人类血细胞亚群进行同步验证分析，以便将实验发现进行多物种验证。
实验技术上，除了进行广泛的功能验证和多种成像方法。作者还建立了一个专用网络资源，用于开放探索年轻和年老小鼠和人类的免疫细胞群。
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