前言
大肠杆菌 F18 诱发的腹泻是仔猪最常见的肠道炎症疾病之一，可导致严重的经济损失。然而，大肠杆菌 F18 感染易感性的分子机制尚不清楚。
近日，江苏省现代农业（生猪）技术体系良种繁育岗位专家、扬州大学动物科学与技术学院包文斌教授为通讯作者，在国际病原学权威期刊 PLoS Pathogens (IF: 6.823) 发表了题为“Insight into mechanisms of pig lncRNA FUT3-AS1 regulating F18-bacterial diarrhea”的研究论文，首次系统解析了 lncRNA 调控仔猪细菌性腹泻抗性的分子机制。
研究结果
1、猪 FUT3-AS1 是与易感性相关的宿主调节因子
为了研究宿主 lncRNA 在断奶仔猪 F18 感染中的作用，对中国地方猪品种梅山猪和培育品种苏太猪 F18 抗性仔猪和敏感仔猪十二指肠组织，分别进行了全转录组测序。结果显示，共有 3 个 lncRNA 同时在 2 个猪种的 F18 抗性和敏感仔猪中存在差异表达（图 A）。其中 FUT3-AS1 (TCONS_00183659) 是位于 FUT3 基因反义链的一个 lncRNA（图 B）。已有研究表明 FUT3 基因与F18 受体的产生有关，且全转录组测序结果显示 FUT3 在 F18 抗性和敏感仔猪中也存在差异表达。
RT-PCR、Northern blot 证实 FUT3-AS1 在 F18 抗性和敏感仔猪中存在差异表达（图 C-D）。
图1｜猪 FUT3-AS1 是与 易感性相关的宿主调节因子
2、下调 FUT3-AS1 可以增强 IPEC-J2 细胞对 的抗性
进一步研究显示， F18 刺激可以引起猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 中 FUT3-AS1 的表达显著上调（图 A）。在 IPEC-J2 细胞中敲降 FUT3-AS1，粘附在细胞上的细菌数量显著降低（图 D-H）。这些结果表明 FUT3-AS1 在调节 18 感染中发挥作用，并且其表达的下调增强了 IPEC-J2 细胞对 18 的抗性。
图2｜下调 FUT3-AS1 可以增强 IPEC-J2 细胞对 的耐药性
3、细胞核中 FUT3-AS1 的作用机制
RNA-FISH 和核质分离实验显示 FUT3-AS1 在细胞核和细胞质中均有分布（图 1 E-F），接下来分别研究它在细胞核和细胞质中的作用机制。
qRT-PCR 和 western blot 显示，FUT3-AS1 敲除后细胞中 FUT3 表达显著降低（图 A）。RNA pull-down 鉴定到 19 个与 FUT3-AS1 结合的蛋白质，其中包含组蛋白 H4。RIP-qPCR 显示组蛋白 H4 可以特异性结合 FUT3-AS1（图 E-F）。ChIP、DNA pull-down 结果显示，组蛋白 H4 可以直接结合到 FUT3 核心启动子区域（图 G-H）。
图3｜FUT3-AS1 通过影响 FUT3 启动子组蛋白 H4K15ac 水平调控 FUT3 转录
使用组蛋白去乙酰化抑制剂处理 IPEC-J2 细胞，可以显著促进 FUT3 的表达，但并不影响 FUT3-AS1 的表达（图 I-J）。ChIP-qPCR 显示，siFUT3-AS1 细胞中 FUT3 核心启动子区域中 H4K15ac 乙酰化水平显著降低（图 L）。
Alibaba 和 JASPAR 软件预测显示有多个转录因子可以结合到 FUT3 启动子区域。双荧光素酶报告实验表明，转录因子 Sp1 的转录结合活性在 siFUT3-AS1 细胞中表现出显著下降、在组蛋白去乙酰化抑制剂 TSA 处理的细胞中显著增强（图 M）。
以上结果表明，FUT3-AS1 可能通过介导 FUT3 核心启动子上的 H4K16ac 水平和 Sp1 结合活性来促进 FUT3 的表达。
4、细胞质中 FUT3-AS1 的作用机制
Small RNA 测序显示在 抗性和敏感仔猪中有 32 个 miRNA 存在差异表达（图 A），并构建了 ceRNA 调控网络（图 B），其中 miR-212 在 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 中都有结合位点。
IPEC-J2 细胞中上调 miR-212 可以显著降低 FUT3 的表达，而下调 miR-212 可以显著促进 FUT3 的表达（图 C-D）。siFUT3-AS1 细胞中 miR-212 表达显著上调（图 E）。荧光素酶报告和 Ago2 抗体的 RIP 实验证实 miR-212 可以直接与 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 结合（图 G-J）。miR-212 inhibitor 可以显著增加细胞上粘附的细菌数量（图 K-L），但同时敲降 FUT3-AS1 时细菌粘附降低。
以上结果，FUT3-AS1 可作为 miR-212 的分子海绵，促进 FUT3 的表达以增强F18 的敏感性。
图4｜FUT3-AS1 作为分子海绵吸附 miR-212 并靶向调节 FUT3
5、FUT3 是防治细菌性腹泻的潜在靶点
FUT3 主要在空肠和十二指肠中表达，并且主要表达于敏感仔猪的小肠上皮黏膜细胞中（图 A-C）。 F18 刺激可以引起 IPEC-J2 细胞中 FUT3 表达（图 E）。FUT3 过表达的 IPEC-J2 细胞粘附的细菌数量明显增加，FUT3 敲除细胞中粘附的细菌数量显著减少（图 I-L）。以上结果表明 FUT3 在 IPEC-J2 细胞对 F18 侵袭易感性中起着关键作用。
图5｜FUT3 是防治 细菌性腹泻的潜在靶点
接下来进一步评估 FUT3 在体内的作用。Fut3 敲除小鼠对 F18 诱导的致死性不敏感，而 Fut3 野生型小鼠的肠道出现明显的病变。Fut3 野生型小鼠体内 IL-6 等细胞因子表达水平显著升高、F18 细菌粘附显著升高。以上结果表明，面对 F18 侵袭，Fut3 野生型小鼠的肠道更容易发生病变，推测 FUT3 是断奶仔猪中抵抗 F18 侵染的潜在靶点。
图6｜FUT3 是防治细菌性腹泻的潜在靶点
6、FUT3-AS1 激活 FUT3 介导的鞘糖脂生物合成和 TLR 信号途径
iTRAQ 蛋白组结果显示，FUT3-AS1 敲降的细胞中 388 个蛋白表达发生改变（图 A），其中多个差异表达蛋白参与了鞘糖脂生物合成途径（图 B），并通过 Western blot 和 qPCR 实验得以证实。敲除或过表达 FUT3、以及刺激同样会引起鞘糖脂生物合成途径蛋白的表达变化（图 E-H）。综上所述，这些结果表明 FUT3-AS1 正向调控 FUT3 表达，激活糖鞘脂生物合成信号。
图7｜FUT3-AS1 调控 FUT3 介导的鞘糖脂生物合成途径
Co-IP 鉴定到 14 个与 FUT3 结合的蛋白质，其中包括 LRRFIP2，并通过 CoIP-western blot 证实（下图 A-C）。并且 LRRFIP2 的表达受到 FUT3 敲除或者过表达的影响（图 D）。
LRRFIP2 是已经报道的 TLR 信号途径的正调控因子。qPCR 显示（图 E-F），FUT3 敲除可以显著抑制 TLR4 信号途径成员表达，反之过表达 FUT3 可以显著激活 TLR4 信号途径。FUT3-AS1 敲降也可以显著抑制 LRRFIP2 的表达。这些结果表明，FUT3-AS1 可能通过促进 FUT3 表达来激活 LRRFIP2/TLR 信号途径。
图 8 | FUT3 与 LRRFIP2 互作以调控 TLR 信号途径
研究结论
本研究以仔猪为动物模型，通过全转录组测序鉴定了一种称为 FUT3-AS1 的反义 lncRNA，并阐明了 lncRNA FUT3-AS1 在 IPEC-J2 细胞中调节 F18 易感性性的相关机制：
在细胞核中，FUT3-AS1 通过增加 H4K16ac 修饰水平促进转录因子 Sp1与 FUT3 核心启动子的结合活性，进而上调 FUT3 表达；在细胞质中，FUT3-AS1 通过竞争性结合 miR-212，调节 FUT3 表达。同时，lncRNA FUT3-AS1 通过激活 FUT3 介导的鞘糖脂生物合成和 TLR 信号途径，来增强 F18 的敏感性。
本研究将为开发新的策略来防治仔猪细菌性腹泻提供理论指导。
扬州大学动物科学与技术学院青年教师吴正常、博士研究生范海瑞为论文共同第一作者。欧易生物在本研究中承担全转录组测序、small RNA 测序及分析工作。
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