前言
母乳微生物是新生儿肠道共生细菌的重要来源，可通过喂养方式从母体传播给新生儿，有助于新生儿初始肠道微生物群的建立，调节新生儿在短期和长期的健康状态。母猪母乳是仔猪出生后三周的主要食物来源，而早期断奶常导致仔猪严重的氧化应激，限制了商业猪断奶后的发育。以往研究主要通过非培养方法了解母猪乳微生物群组成和群落多样性，未曾使用培养依赖方法系统地研究可能间接或直接有利于早期断奶仔猪精确护理的母猪乳微生物群。
6 月 1 日，湖南师范大学生命科学院尹佳教授和中国科学院亚热带农业生态研究所的印遇龙院士为通讯作者，在 Microbiome 期刊（IF=14.652）发表了题为“Antioxidant potential of Pediococcus pentosaceus strains from the sow milk bacterial collection in weaned piglets”的研究论文，报道了母乳菌群的戊糖片球菌SMM914可激活仔猪肝脏中抗氧化信号通路Nrf2-Keap1，为阐明母猪乳细菌对促进仔猪健康发育提供新的见解。
研究内容解析
建立母猪乳细菌收集法(smBC)
采用母猪乳收集法、厌氧培养法和测序法等手段对母猪乳微生物群(SMM)进行了大规模培养和鉴定，共获得了1240株分离株，通过在CD-HIT分析，将这些分离株划分为271个细菌类群，利用 silva 16SrRNA 数据库、NCBI核苷酸数据库和DAIRYdb内参基因数据库将这些序列分为两类：疑似新细菌物种和已鉴定的物种。
基于序列之间的距离，建立的系统发育树显示有120个类群不能被分配到任何已鉴定的物种（图1），内圆圈描述了被分离出来的细菌的分类，其中绿色表示变形菌门，黄色表示厚壁菌门，红色表示戊糖片球菌，每个分类节点上提供每个物种内不同分类群的数量。外环上绿色或黄色的色阶表示从乳制品中识别出的疑似新物种和已知物种的概率（%）。
图1 | 母猪乳汁中的细菌收集与鉴定
筛选戊糖片球菌类的益生菌
对病原菌活性拮抗以控制其传播，是猪潜在益生菌菌株的重要筛选标准，通过抑菌实验评估不同戊糖片球菌分离株对常见病原菌的抗菌活性，筛选到10株抗菌活性最强且菌株形态为圆形、成对或四联体的候选益生菌（图2a）。黑腹果蝇模型实验通过百草枯处理评估果蝇存活率进一步筛选具有强抗氧化活性的益生菌（图2b-c），结果显示在百草枯处理45小时后，有戊糖片球菌SMM914定植的果蝇在百草枯刺激下的存活率显著提高，表明戊糖片球菌SMM914在果蝇中具有抑菌活性，增强了果蝇对百草枯诱导胁迫的抗性。进一步对SMM914的基因组进行测序，共产生28个序列，总大小为1,924,818bp，GC含量为37.14%。通过对SMM914的注释，存在抗氧化应激相关基因，包括有机酸、硫氧还蛋白和胞外多糖等。
图2 | 戊糖类益生菌候选菌株的筛选
戊糖片球菌SMM914对仔猪抗氧化能力的影响
仔猪出生后，分别在第10、12、14、16和18天口服低剂量（LD）或高剂量（HD）戊糖片球菌SMM914(图3a)，肝脏疾病生物标志物丙氨酸转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)均降低（图3b）。肝脏中Nrf2蛋白表达水平显著升高，Keap1蛋白水平受到显著抑制(p<0.05)，但也导致醌氧化还原酶(NQO-1)、过氧化氢酶(CAT)、血红素氧合酶1(HO-1)和超氧化物歧化酶(SOD)的蛋白水平升高，且呈浓度依赖性（图3c-e）。
在酶活性测定中，HD组同时增加了肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、CAT活性和SOD活性(p<0.05)(图3g)。此外，与对照组相比，HD组显示肝脏中脂质过氧化的最终产物丙二醛(MDA)浓度显著降低(图3g)。这些数据表明，戊糖片球菌SMM914可通过激活Nrf2-Keap1抗氧化信号通路提高仔猪抗氧化能力，并减轻断奶期间的肝损伤。
图3 | 戊糖片球菌SMM914对仔猪抗氧化能力和细胞保护性Nrf2通路激活的影响
戊糖片球菌SMM914对仔猪抗氧化能力的影响
为了更好地了解戊糖片球菌SMM914的抗氧化作用，进一步检测了三组样本血浆的代谢谱(n=7)。PLS-DA图显示出最优拟合优度(R=0.996，Q=0.681(图5a)；R=0.994，Q=0.479(图4b)，表明该模型具有良好的预测性和可靠性。
代谢组学结果表明，戊糖片球菌SMM914处理后主要影响的代谢物和代谢途径包括谷胱甘肽代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，类固醇激素生物合成和初级胆汁酸生物合成（图4d-h）。此外，KEGG通路富集表明戊糖片球菌SMM914对断奶仔猪的保护作用可能通过图5c所示整合的代谢途径进行。
图4 | 血浆的代谢图谱
SMM914对仔猪结肠微生物群的影响
断奶仔猪从母乳到固体饲料的转变，肠道微生物群组成的紊乱可通过肝-肠轴诱导氧化应激，采用16S rRNA基因扩增子测序技术对仔猪结肠微生物群进行了进一步研究，三组共有的细菌群落有89个属，LD组和HD组特有11个和20个属；NMDS图直观显示高剂量HD组和对照组样本在距离上能明显区分开(stress=0.054，R=0.8630，p=0.001，ANOSIM)，但低剂量LD组的样本没有在ASV水平上与对照组很好地分离(图5b-c)；群落结构则显示HD组在科和属水平上均表现出明显的群落变化，高剂量口服戊糖片球菌SMM914使仔猪结肠微生物菌群富含乳酸菌（乳酸菌消耗与氧化损伤有关）、克里斯滕森菌科R-7（正调控肠道免疫反应）和瘤胃球菌科UCG-005属（与肝功能衰竭呈负相关），而对照组结肠微生物群中拟杆菌科和普雷沃菌科属（已报道与各种疾病相关）相对丰度较高，这些结果表明戊糖片球菌SMM914在仔猪早期断奶应激过渡过程中正向调控肠道菌群。
图5 | 结肠内的微生物多样性组成分析
研究结论
本研究利用培养组学从母猪乳中分离乳酸菌，建立了一套快速筛选潜在有益菌株的方法。就产自母猪乳汁的新型戊糖片球菌的益生菌特性而言，在猪饲养试验中，给予戊糖片球菌SMM914可通过降低血浆中白蛋白ALT和总蛋白TP水平从而降低仔猪在断奶期间潜在的肝损伤。此外，口服戊糖片球菌SMM914可提高仔猪心脏系数，激活肝脏Nrf2-Keap1通路，干扰血浆中氨基酸代谢物水平并增加结肠中的有益微生物群。总之，本研究阐明了母猪乳微生物群在母猪和后代之间的重要性，并扩展了对戊糖菌益生菌潜力的理解。
图6 从母猪母乳中进行大规模细菌培养的流程
湖南师范大学王乐莅为第一作者。欧易生物在本项目中承担了代谢组学实验和生信分析工作。
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