利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
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工程菌种
稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
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高密度发酵培养基
除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。若将酵母膏和蛋白胨同时加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸。
无机氮源的选择：(NH4)2HPO4为无机氮源时，(NH4)2HPO4自身含有的元素P可促进菌体生长。以(NH4)2SO4作为无机氮源时，S元素也可促进菌体生长。而硝酸盐中的N原子不能被菌体直接利用，需要将其N原子还原成NH4 才能利用，在这一过程需要消耗一定的能量，因此菌体的生长受到了一定的限制，所以使用NaNO3或NH4NO3作为无机氮源时获得的菌体量相对较少，不易实现高密度培养。
高密度发酵中，微量元素的作用也是不容忽视的，某种微量元素的缺失可能造成菌体量的大幅减少甚至生长受阻。此外，如果所用的菌种在构建时进行了必要的基因敲除，有些物质（一般是维生素或氨基酸）无法自身合成，如生物素、硫胺素等就必须辅助性添加。
无机盐组分不仅用于维持细胞渗透压或发酵环境pH稳定，其本身往往也参与到细胞代谢之中，如镁离子是许多酶活性的中心，用法用量需要反复优化。
此外，泡敌是对菌体生长明确有毒害作用的成分，在不影响消泡效果的前提下，有必要摸索其用量的下限作为使用浓度，以减少对菌体的损伤，尤其在种子培养阶段。
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级联控制溶氧
溶氧（DO）是需氧微生物生长所必需，在发酵过程中受很多方面因素的影响。28℃时氧在发酵液中的饱和浓度只有7mg/L，比糖的溶解度小7000倍。高密度发酵中，菌体代谢强度大，溶氧需求量极高，对设备供氧能力要求也相应较高，DO往往成为生长代谢限制因素。为避免DO失控，DO设定值通常会处于较低的水平。由于DO电极校准时存在偏差或者电极老化检测数据本身就不准确，很可能导致罐内缺氧时未被发及时发现。判断发酵过程是否受氧的限制，最简单的办法是把培养温度降低2~4度（不影响发酵前提下），根据溶氧浓度变化趋势来了解氧的供需情况。如果降温后DO迅速回升，说明目前供氧状况良好；如果降温后DO值并无回升响应，此时DO检测值很可能属于“假阳性”，说明罐内处于一定程度的缺氧状态。
培养液中的溶氧浓度的变化反映了菌体的生理状况。通常在对数生长期DO明显下降，从其下降的速率可估计菌的大致生长情况。DO低谷到来的迟早与低谷时的DO水平随工艺和设备条件而异。二次生长时DO往往会从低谷处上升，到一定高度后又开始下降，这是利用第二种基质的表现。值得注意的是，在培养过程中并不是维持DO越高越好。即使是专性好气菌，过高的DO对生长也可能不利。氧的有害作用是通过形成单线态氧、超氧化物基O2-、过氧化物基O22-或羟基自由基OH-，可破坏许多细胞组分。过氧化物基O22-或羟基自由基OH-，可破坏许多细胞组分。
溶氧控制方法：
在遵循先罐压后搅拌再流量的调控顺序原则上，改善溶氧的手段有以下几种：
①在通气中掺入纯氧或富氧，使氧分压提高；
②提高罐压，能有效增加溶氧，但同时也会增加溶解CO2的浓度，因为它在水中的溶解度比氧高30倍。这会影响pH和菌的生理代谢，所以提高罐压要控制在合理的范围内，大肠杆菌发酵一般控制0.03~0.08MPa以内。
③改变通气量，其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分；在罐压较大的情况下增加空气流量，DO提高的效果显著。但在罐压较小的情况下提高空气流量，对氧溶解度的提高不明显，反而会使泡沫大量增加，导致逃液。大肠杆菌发酵常用通气量为0.5~1.5VVM。
④提高设备的供氧能力，从改善搅拌考虑更容易收效。改变搅拌器直径或搅拌桨叶角度可增加功率输出。另外调整挡板的数目和位置，也可使剪切效果发生变化。比如四斜叶（萊宁A315搅拌桨）比其他桨叶能更有效地应用于高密度发酵中，并能显著地减少功耗，在相同扭矩和功率下，四斜叶的传质效率比Rushton桨叶高出30%。不同搅拌设计的溶氧分布效果差别非常大，见下图：
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温控代谢
大肠杆菌发酵最适温度是37 ℃，当温度最适菌体生长时，比生长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。有时降低温度更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同，为了能获得大量的目的蛋白，首先要保证菌体的量，因此在前期可优先考虑菌体的生长，到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。大肠杆菌的不同克隆，诱导表达的温度差异比较大，常用的有20度~32度，更高的诱导温度意味着包涵体生成的概率成倍增加。
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pH作用机理
发酵过程中培养液的pH值变化是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是发酵过程中重要参数，对微生物的生长和产物的积累有很大的影响。培养基中的碳/氮比不合适，碳源过多，特别是葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，致使糖等物质的氧化不完全，培养液中有机酸大量积累，会导致pH下降；培养基中碳源缺乏，或培养基中的碳/氮比不当，氮源过多会使pH值上升。
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诱导策略之分段工艺设计
对于带有诱导型启动子的重组微生物，选取合理的诱导时机非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内。选在此时诱导，可将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达。而且此时已经得到了一定量的菌体，从发酵动力学角度，以及能耗、物料成本方面，都比较合理。相较于诱导时机，诱导剂浓度并不那么重要，如果诱导时菌浓OD值在50以内，那么用0.1mM的IPTG进行诱导就足够了。
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代谢途径之乙酸生成（大肠杆菌）
大肠杆菌有氧代谢产乙酸有两条途径，分别为丙酮酸氧化酶路径（poxB）和乙酸激酶/磷酸乙酰转移酶路径（ackA-pta）。发酵液中乙酸以HAc和Ac－形式共存，HAc能渗透过细胞膜，在细胞内（pH约为7.5）再分解为H＋和Ac－。由于不断渗透使胞外HAc和Ac－之间平衡向HAc移动，结果引起一个净电中性H＋内流，降低了胞内pH。细胞自身的稳态机制需要能量以改变胞内pH降低趋势，从而破坏了跨膜质子梯度，而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它跨膜运输所必需。也有报道认为乙酸等短链脂肪酸对DNA、RNA、蛋白质、脂质和肽聚糖等的合成均有抑制，而这些大分子物质是菌体生长和外源蛋白表达所必需的。通过HPLC在210nm下或者酶联反应在450nm下比色可以精确测定乙酸浓度。一般认为在好气性条件下，5～10g/L的乙酸浓度就能对比生长速率、菌体浓度以及后期蛋白收率等产生可观测到的抑制作用。当培养液中乙酸浓度大于12g/L时外源蛋白的表达完全被抑制，当乙酸浓度大于15g/L时，细胞将会停止生长。
发酵调控减少乙酸浓度的措施：
01
改变培养基组分
培养基成分对乙酸的产生影响较大，尤其是碳源的选择。研究表明目前最常用碳源的葡萄糖作为碳源时，极易导致乙酸生成，而用甘油取代葡萄糖则可以避免乙酸积累。利用复合碳源葡萄糖 果糖、葡萄糖 麦芽糖取代单一碳源葡萄糖可改善大肠杆菌细胞代谢碳源流向，更有利于目的产物的表达。
流加补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易形成较多的乙酸，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。此外，根据经验，对于一个稳定的发酵工艺，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
02
降低比生长速率
比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。DO-stat，pH-stat,指数流加，复合式流加等发酵技术的应用对于解决发酵中的乙酸积累问题起了较大作用。需要注意的是，溶氧反馈和pH反馈调节补料的同时，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快。
较低的比生长速率虽然产酸少，但同时会延缓细胞的生长导致发酵周期延长,往往最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成。因此选取合适的比生长速率对于高密度、高表达发酵有重要意义。大肠杆菌比生长速率：μ=（In N2 - InN1) / (t2-t1)，其中，N1表示时间t1时的单位体积生物量，N2表示时间t2时的单位体积生物量。
03
限制性流加葡萄糖
大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，该模式能有效的优化微生物培养过程中的化学环境，使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。
葡萄糖为碳源进行补料分批培养重组大肠杆菌时，采用限制性流加的方法控制其浓度在较低的范围内以减少乙酸的生成，是目前高密度发酵常用的技术。一个好的流加控制系统必须避免两种倾向：一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。比如恒溶氧反馈法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。
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噬菌体问题（细菌类工程菌）
染菌一直是困扰整个发酵工业的难题。而在工程菌发酵中，相比于染菌问题，噬菌体污染更为常见。污染工程菌发酵的噬菌体包括烈性噬菌体和温和噬菌体两种。烈性噬菌体浸染菌体后能够在宿主菌体内快速复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌，极短时间内就可使发酵液澄清化（菌体刚开始裂解会释放核酸物质使发酵液变得粘稠，随后逐渐澄清）；温和噬菌体感染宿主菌后并不马上开始增殖。而是将其基因整合于细菌染色体上，随细菌染色体的复制而复制，并随细菌分裂而分配至子代细菌的染色体中，形成前噬菌体，这个过程称为温和噬菌体的溶原性生长周期。在某些理化或生物因素的诱导下，整合的前噬菌体脱离宿主菌染色体，产生新的子代噬菌体，并使宿主菌裂解，这个过程叫溶菌性生长周期。
8.1
大肠杆菌浸染毒性噬菌体的鉴定
1.配制培养基：
LB液体培养基（1000ml水,10g蛋白胨：5g酵母粉：5g氯化钠）、1.5%的固体培养基、0.7%的半固体培养基；
2.倒平板：将1.5%的固体培养基溶化，每个平板倒10-15ml的1.5%固体培养基，然后静置至平板上没有水珠为宜；
3.分装0.7%的半固体培养基：将0.7%的半固体培养基加热溶化，然后用5ml的移液枪向每个试管加入5ml的半固体培养基；试管的数量和上一步平板数是相同的；
4.等到试管中培养基温度降至40℃左右时（不烫手），迅速向试管中加入100ul敏感菌和100ul的待测噬菌体液，摇匀；
5.将摇匀好的该培养基迅速倒入之前已倒有1.5%固体培养基平板中，晃动平板，使其铺满平板，静置；
6.待所有平板倒好后，将其放入30℃恒温箱中培养12h左右，即可观察有无噬菌斑。
8.2
减少或避免噬菌体浸染的防范措施
1. 从菌种构建开始，克隆菌种的感受态细胞及其它试剂要保证纯净没有被污染；
2. 发酵系统中的空气系统要定期消毒并检查；
3.发酵种子活化的环境要保持洁净，并定期消毒；
4.发酵罐接种时要无菌操作，发酵过程取样后的废液要进行收集灭菌处理；
5.发酵过程的尾气要通入吸收液处理后再排掉；
6.定期检修发酵罐避免消毒死角的存在，发酵系统中的补料设施也要进行检查；
7.发酵场所的地沟，排水池等要保持清洁，保证无活菌排放，并定期消毒；
8.3
浸染噬菌体后的处理措施
工程菌发酵浸染噬菌体还是以预防为主，一旦爆发后可通过以下措施进行处理：首先，通过双层平板去排查是否是浸染了毒性噬菌体。若是温和噬菌体则难以发现，会让发酵过程间断性的发生异常，此时可通过PCR等方法确认是否浸染了温和噬菌体。其次，确定浸染噬菌体后，就要从菌种、培养基、发酵系统管路、地沟、污水池、菌种室等进行全面的消毒，通常需要物理和化学方式相结合。如下措施供参考：
1.暂停发酵生产工作，用紫外灯照射加甲醛熏蒸的方式对整个发酵场所进行消毒一个月；
2.对现有菌种库做严格的噬菌体检测，一旦发现污染痕迹，马上和其它菌种隔离并进行灭活处理；
3.用甲醛、臭氧或二氧化氯熏蒸发酵小试间、菌种室等位置；
4.用化学消毒剂（譬如75%酒精、新洁尔灭、二氧化氯稀溶液等）清洁试验台、实验室墙面和设备等表面；
5.一旦爆发噬菌体污染，停止任何形式的活菌排放，杜绝或尽量减少活菌开放性操作；
6.多点取样进行噬菌体培养验证，以检验灭活效果，直至无噬菌斑出现方可复产。
