研究背景
阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是一种非常普遍的慢性睡眠障碍，以睡眠中反复出现的部分或完全咽部塌陷为特征，伴有慢性间歇性缺氧（CIH）。OSA被认为是发生全身性高血压的独立危险因素。然而，OSA引起高血压的确切机制尚不完全清楚。有证据表明，血管内皮功能障碍是OSA心血管并发症前最早期的临床表现。因此，对CIH状态下内皮功能障碍的分子机制进行整体分析，有助于全面了解OSA或CIH相关性高血压的发病机制。
近日，首都医科大学附属北京安贞医院北京心肺血管疾病研究所张慧娜研究员作为第一作者和通讯作者，在Theranostics（IF: 11.556）期刊发表了题为“Extracellular vesicle-derived miR-144 as a novel mechanism for chronic intermittent hypoxia-induced endothelial dysfunction”的论文，文章结果不仅扩大了涉及血管内稳态的血源性物质的范围，同时提示负载anti-miR-144的细胞外囊泡可作为一种潜在的治疗阻塞性睡眠呼吸暂停或慢性间歇性缺氧相关内皮功能障碍的方法。
研究结果
慢性间歇性缺氧可引起内皮功能障碍，促进超氧阴离子自由基的产生，抑制NRF2的表达
为了确定CIH诱导内皮功能障碍的机制，作者用表达谱芯片检测C57BL/6小鼠在常氧(N)、CIH (C)和30天CIH后15天常氧（Re-Nor post-CIH）条件下主动脉中差异表达的基因。在CIH和常氧(N)中发现了743个显著差异表达的编码基因，在Re-Nor post-CIH组中伴随有逆转趋势，其中只有NRF2基因同时与血管收缩和扩张、活性氧生成、炎症和血管生成相关（图1B-C）。经过WB验证，CIH暴露30天的C57BL/6小鼠主动脉中NRF2及其下游靶点CATALASE (CAT)水平显著降低，Re-Nor post-CIH组恢复（图1D）。
图1 | CIH处理会损害内皮依赖性舒张（EDR），降低NRF2的表达，促进超氧阴离子的产生
CIH处理的C57BL/6小鼠血清EVs (CIH S-EVs)损害内皮功能，增加超氧阴离子的产生，降低NRF2表达
作者首先用透射电镜、标记蛋白评估了S-EVs的特征，同时发现CIH S-EVs的数量大约是常氧组的2倍（图2A-D）。随后，作者发现CIH血清处理48小时可以减弱小鼠主动脉中的EDR，而无EV血清处理则没有这种抑制作用。直接暴露于CIH S-EVs 48小时可以减弱C57BL/6小鼠胸主动脉中的EDR，减少C57BL/6小鼠肠系膜动脉中的血流介导扩张。染色实验显示S-EVs可以被主动脉内皮细胞吸收（图2E）。
图2 | C57BL/6小鼠血清中分离的EVs可被主动脉内皮细胞吸收
为了进一步明确CIH S-EVs是如何对EDR产生不利影响的，作者使用表达谱芯片来检测CIH S-EVs或Nor S-EVs处理的HUVECs中差异表达的基因，两组间有19个显著差异表达的编码基因（图3D）。其中，只有NRF2同时是前期CIH处理小鼠主动脉比较组中的差异表达基因（图3D）。
进一步的验证表明，CIH S-EV体外处理确实降低了NRF2及其靶点CAT在小鼠内皮细胞系H5V和小鼠主动脉中的蛋白表达（图3E）。此外，CIH S-EV处理可增加H5V细胞和主动脉内皮细胞中超氧阴离子的产生，而ROS清除剂可阻断这一作用，这表明NRF2的降低可能是CIH S-EVs诱导内皮细胞超氧阴离子过量产生的主要分子（图3F-G）。
图3 | CIH S-EVs损害内皮功能，增加超氧阴离子的产生，降低NRF2表达
miR-144在CIH S-EVs中升高
为了确定CIH S-EVs降低NRF2和损伤内皮功能的机制，作者通过qPCR检测了常氧和CIH处理的小鼠S-EVs中与氧化应激或缺氧信号相关的miRNAs。在CIH S-EVs中，miR-126水平降低，而miR-132、miR-150、miR-27a和miR-144水平升高（图4A）。过表达miR-144和miR-27a可以降低H5V中NRF2及其靶点CAT的蛋白水平（图4C），并抑制293A细胞中NRF2 3’ UTR的荧光素酶活性（图4D）。
间歇性缺氧(IH)处理H5V细胞24小时后，qPCR结果显示，miR-27a在内皮细胞中内源性表达，并对IH刺激做出反应（图4E-F）。在H5V细胞中几乎检测不到miR-144的表达，但CIH S-EVs处理显著增加了H5V细胞中miR-144的丰度，提示内皮细胞miR-144信号主要来自S-EVs（图4G-H）。因此，作者选择EV miR-144作为进一步研究的靶分子。
图4 | miR-144在CIH S-EVs中增加，并通过S-EVs传递到内皮细胞
CIH暴露小鼠的红细胞源性细胞外囊泡（CIH E-EVs）中miR-144升高
为了明确miR-144在CIH S-EVs中的细胞来源，通过超离心从C57BL/6小鼠红细胞中分离红细胞来源的细胞外囊泡（E-EVs），通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、标记蛋白等鉴定E-EVs(图5A-C)。qPCR检测显示，在CIH处理的C57BL/6小鼠红细胞和OSA患者红细胞中的E-EVs中，miR-144均显著上调(图5D-E)。
图 5｜分离的E-EVs和miR-144在E-EVs中的表达特征
HIF-1α和GATA1介导CIH E-EVs中miR-144的上调
为了进一步证明EV介导的红细胞和内皮细胞之间的细胞交流，作者检测C57BL/6小鼠在常氧(N)、CIH (C)和30天CIH后15天常氧（Re-Nor post-CIH）条件下红细胞和内皮细胞中pri-miR-144和成熟miR-144的水平。结果显示，CIH组中红细胞中pri-miR-144和miR-144表达均显著升高，在主动脉内皮细胞中，只有miR-144上调（图6A-B），这表明内皮细胞中的miR-144极有可能从体内的红细胞外源性转移。
小鼠红细胞白血病(MEL)细胞在连续缺氧、间歇性缺氧或DMOG（HIF-1α稳定剂）后miR-144上调（图6C）。作者突变了miR-144启动子上的GATA1结合位点，并研究了间歇性缺氧和HIF-1α敲低对突变的miR-144启动子活性的影响（图6D-I）。结果表明，缺氧过程中miR-144可直接受HIF-1α调控或间接受HIF-1α/GATA1通路调控。
图6｜间歇性缺氧红细胞中miR-144的表达与调控
Anti-miR-144阻断CIH E-EVs诱导的NRF2表达、超氧阴离子产生和内皮功能障碍
为了进一步验证CIH E-EVs传递miR-144对内皮细胞的影响，作者使用anti-miR-144和anti-miR-144负载的CIH E-EVs体外治疗主动脉或在体内治疗CIH小鼠。体内CIH E-EV处理增强内皮细胞超氧阴离子的产生，但是在anti-miR-144负载的CIH E-EV处理组中被很大程度上抑制（图7C-D）。同时，体内CIH E-EV处理会引起EDR受损，收缩压升高。这些效应在anti-miR-144负载的CIH E-EVs处理组中减弱（图7E-F）。antagomiR-144显著逆转了来源于CIH小鼠或OSA患者的E-EV引起的内皮功能障碍（图7G-H）。
图7｜Anti-miR-144阻断CIH E-EVs诱导的NRF2表达、超氧阴离子产生和内皮功能障碍
研究结论
本研究系统地证明了CIH S-EVs和CIH E-EVs可以向内皮细胞传递功能性的miR-144，通过降低NRF2表达促进超氧阴离子的产生。本研究为负载anti-miR-144或antagomir-144 EV治疗OSA或CIH相关血管并发症提供了实验证据。
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