前言
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的一种严重并发症，目前是致盲的主要原因之一。研究表明大量活化的小胶质细胞和炎性巨噬细胞参与 DR 的发展。然而，由小胶质细胞/巨噬细胞驱动的适应性免疫炎症在 DR 中的作用尚不清楚。
Kdm6a 负责去除组蛋白 3 赖氨酸 27 (H3k27) 上的二甲基和三甲基基团，并激活靶基因转录。Kdm6a 与小胶质细胞/巨噬细胞之间的关系以及 Kdm6a 导致糖尿病视网膜病变的分子机制尚不清楚。
近日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院/上海市五官科医院韦严副研究员为通讯作者，在内分泌领域权威期刊 Metabolism (IF: 13.934)在线发表了题为“Kdm6a deficiency in microglia/macrophages epigenetically silences Lcn2 expression and reduces photoreceptor dysfunction in diabetic retinopathy”的研究论文，发现了糖尿病视网膜病变小胶质细胞/巨噬细胞中的 Kdm6a 通过控制 Lcn2 的表达抑制光感受器细胞的糖酵解过程。
研究结果
1、Kdm6a 在糖尿病视网膜病变中上调碍
通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立了糖尿病小鼠模型（图 1A-C），Kdm6a 蛋白和 mRNA 表达在糖尿病视网膜中升高（图 1D）。暴露于高糖条件下的小胶质细胞中 Kdm6a 表达也明显上调（图 1E-G）。并且小胶质细胞/巨噬细胞中 Kdm6a 缺乏可能减轻 DR 诱导的视网膜功能丧失（图 1H）。
图 1 | 糖尿病小鼠视网膜中 KDM6A 的表达
2、Kdm6a 敲降可以降低体内外糖尿病视网膜病变的炎症反应
与对照相比，Kdm6a 条件敲除小鼠视网膜中蛋白 Tnfα 和 iNos 表达下调（图 2A）。高糖条件下特异性敲降 Kdm6a，可以导致 BV2 细胞中蛋白 CD11b 和 CD86 表达降低（图 2B-C），Il1β、Tnfα、iNos、Il6 mRNA 表达降低（图 2D）。特异性敲降 Kdm6a，可以促进 IL4 刺激的 BV2 细胞表面的 CD206 表达（图 2F），促进 Ym1、Il13、Il10、Arg1 mRNA 的表达（图 2E）。以上结果表明，Kdm6a 有助于 DR 中小胶质细胞/巨噬细胞的 M1 极化。
图 2 | 小胶质细胞中 KDM6A 敲降在体内可以减轻糖尿病视网膜病变的炎症，在体外调节小胶质细胞的极化
3、高糖通过 Kdm6a 依赖性调节增强视网膜小胶质细胞/巨噬细胞中 Lcn2 的表达
接下来，对高糖条件下的小胶质细胞/巨噬细胞进行转录组测序。与对照相比，Lcn2 是高糖刺激下上调为明显的分泌蛋白基因（图 3A）。糖尿病小鼠模型中 Lcn2 的蛋白和 mRNA 表达也显著增加（图 3B）。结果表明，在 DR的小胶质细胞中 Lcn2 的表达增加。
图 3 | 糖尿病小鼠小胶质细胞中 LCN2 的表达
对 si-Kdm6a 的 BV2 细胞进行转录组测序，结果显示 Lcn2 表达显著下调（图 4A）。si-Kdm6a 的 BV2 细胞中，高糖暴露诱导的 Lcn2 的表达并显著抑制（图 4D）。无论细胞是否暴露于高糖，si-Kdm6a 的 BV2 细胞上清中的 Lcn2 蛋白水平低于对照（图 4E）；相反，在 BV2 细胞中过表达 Kdm6a 可以显著促进 lcn2 蛋白和 mRNA 的表达（图 4F-G）。
由于 Kdm6a 作为针对 H3k27me3 的去甲基化酶发挥作用并上调靶基因，结果显示，Kdm6a 敲降显著增加了 Lcn2 启动子区域 H3k27me3 甲基化水平（图 4H），反之 Kdm6a 过表达降低了 H3k27me3 甲基化水平（图 4I）。
以上结果表明，Kdm6a 直接降低了 Lcn2 基因的 H3k27me3 修饰水平，并促进了 Lcn2 表达。
图 4 | Kdm6a 对BV2 细胞中 Lcn2 表达的影响
4、Lcn2 通过抑制糖酵解而破坏感光细胞的功能
IRBP 蛋白在视觉周期中起重要作用，对光感受器的维持至关重要；外周蛋白是视盘膜的组分之一。小鼠眼睛玻璃体腔注射重组 Re-Lcn2，小鼠视网膜中 IRBP 和外周蛋白表达水平降低（图 5C）。对 Re-Lcn2 处理的 661W 细胞进行非靶向代谢组和转录组测序联合分析，结果显示 Re-Lcn2 主要抑制了细胞中糖酵解过程（图 5F）。代谢组检测结果显示 Re-Lcn2 处理显著降低了细胞和培养基中乳酸水平（图 5E, I）。
图 5 | Re-Lcn2 通过阻断糖酵解进程损害感光细胞的细胞活力
收集高糖暴露的 Lcn2 敲降的 BV2 细胞培养基，并与 661W 细胞孵育，结果显示 sh-Lcn2 可以抵抗高糖对 661W 细胞的损伤（图 6B），细胞的乳酸增加（图 6D）。Kdm6a 过表达的 BV2 细胞培养基与 661W 细胞孵育，可以降低 661W 细胞的存活率；而 sh-Lcn2 + OE-Kdm6a 的 BV2 细胞培养基与 661W 细胞孵育，可以恢复 661W 细胞的活力（图 6C），增加细胞的乳酸产生（图 6G）。
以上表明，来自小胶质细胞/巨噬细胞的 Lcn2 的增加损害了感光细胞的糖酵解进程。
图 6 | BV2 细胞中 Lcn2 的敲降促进了 661W 细胞活性
5、小胶质细胞/巨噬细胞中的 Kdm6a 缺乏维持光感受器中正常的糖酵解过程
条件敲除小鼠 IRBP 和外周蛋白表达升高（图 7A-B）。si-Kdm6a BV2 细胞培养基与 661W 细胞孵育（图 7C），661W 细胞中 IRBP 蛋白表达水平显著上升（图 7D），661W 细胞的存活率升高（图 7E），细胞上清中乳酸含量增加（图 7F）。Kdm6a 敲除减弱了 Re-Lcn2 对 661W 细胞中乳酸排泄的抑制作用（图 7F）。暴露于 Re-Lcn2 的 BV2 细胞中 Kdm6a 敲降后，661W 细胞中糖酵解的主要酶活性的变化升高（图 7I）。
以上结果表明，小胶质细胞/巨噬细胞中Kdm6a的缺失维持了光感受器的正常糖酵解，并减少了糖尿病视网膜病变的损害。
图 7 | KDM6A 敲除降低糖尿病视网膜病变中感光细胞的功能障碍，并通过维持正常的糖酵解过程恢复感光细胞的活力
6、Kdm6a 和 Lcn2 的减少直接改善糖尿病视网膜病变
接下来在体内研究 Kdm6a 和 Lcn2 的作用。将 siRNA 注射到小鼠玻璃体腔中以干扰 Kdm6a 和 Lcn2 表达，结果显示 IRBP 和周边蛋白表达升高（图 8 C-D），表明体内干扰 Kdm6a 和 Lcn2 可以改善糖尿病视网膜病变。
图 8 | 通过玻璃体内注射 siRNA 降低 Kdm6a 和 Lcn2 的表达可以减轻糖尿病小鼠的视网膜病变
研究结论
本研究用条件敲除小鼠建立了糖尿病动物模型，以研究 Kdm6a 缺乏的影响。
结果显示，糖尿病小鼠视网膜中 Kdm6a 的表达增加。小胶质细胞/巨噬细胞中的 Kdm6a 以去甲基化酶活性依赖的方式调节 Lcn2 的表达，并通过 Lcn2 抑制光感受器细胞中的糖酵解进程。这些结果表明，小胶质细胞和巨噬细胞中的 Kdm6a 通过促进 Lcn2 表达和损害光感受者细胞中的糖解进程而加重糖尿病视网膜病变。
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