前言
2022年5月，南京中医药大学霍介格、中国农业科学院上海兽医研究所陈兆国团队（一作：蔡梦梦）联合在Frontiers in Pharmacology期刊（IF：5.988）发表了题为“Disordered Gut Microbiota in Colorectal Tumor-Bearing Mice Altered Serum Metabolome Related to Fufangchangtai”的研究成果，通过血清代谢组的研究方法，探究了FFCT作用的机理，描绘了小鼠微生物菌群影响图谱。为探讨肠道微生物群（GM）与血清代谢的关系提供了理论依据。
中文标题：结直肠癌荷瘤小鼠肠道菌群紊乱与复方肠泰相关的血清代谢组改变
研究对象：结直肠癌荷瘤小鼠
发表期刊：Frontiers in Pharmacology
影响因子：5.988
发表时间：2022年5月
运用组学技术：微生物16S rRNA测序、血清代谢组学
研究背景
结直肠癌（CRC）是一种影响结肠或直肠的癌症。尽管由于人口筛查和内镜监测，CRC患者的死亡率正在稳步下降，但就发病率和死亡率而言，CRC仍然是世界上第三高的。肠道微生物群（GM）一旦失去平衡，就会导致一些系统性疾病的发生。许多证据表明，CRC的发展与GM生态失调之间有很强的相关性，CRC治疗的方法有很多，包括根治性手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等，但由于这些方法都有局限性，并会造成许多副作用。由于中药的协同和衰减作用，在预防肿瘤复发和转移方面起着不可或缺的作用。
根据临床经验，处方复方肠泰（FFCT）通过增强免疫系统、提高患者生活质量、减少副作用已被证明具有抗肿瘤作用。尽管GM可以与中药成分进行复杂的互动，但是否会影响中药对结直肠癌的疗效仍然是未知的。因此，作者以FFCT作为中药处方模型，探讨了中药治疗中转基因与中药代谢的相关性。
研究思路
研究方法
1.实验材料
人参、猕猴桃、红芪、枳实、薏苡仁、苦参等六种中药颗粒剂制备FFCT。
2.肠道微生物群检测实验
(1)实验分组
PBS组：正常小鼠注射PBS并给予ddH2O
CT26组：CRC荷瘤小鼠给予ddH2O
CT26L组：CRC荷瘤小鼠服用0.65 mg/g FFCT
CT26M组：给予1.3 mg/g FFCT的CRC荷瘤小鼠
CT26H组：给予2.6 mg/g FFCT的CRC肿瘤小鼠
(2)技术路线
给药前，皮下接种CT26-LUC细胞到小鼠侧翼（CRC荷瘤组），同时皮下接种PBS（PBS组）。PBS组和CT26组服用约ddH2O，其他组通过灌胃方式服用FFCT混悬液，并服用药物4周。给药27天后收集小鼠粪便样本和分离血清样本。
3.复方长泰血清代谢组学实验
(1）实验分组
对照组：正常小鼠注射PBS并给予ddH2O
CT26组：CRC荷瘤小鼠给予ddH2O
CT26H组：给予2.6 mg/g FFCT的CRC荷瘤小鼠
CM组：给予PBS并给予2.6 mg/gFFCT的正常小鼠
(2)技术路线
给药前，皮下接种CT26-LUC细胞，皮下接种于小鼠的侧腹(CT26组和CT26H组)，同时皮下接种PBS(对照组和CM组)。CT26H组和CM组灌胃FFCT混悬液，给药持续4周。从小鼠的眼球中抽取血液，收集上清液并储存在干冰中用于血液质谱分析。
4.粪便微生物移植实验
(1)实验分组
将小鼠随机分为两组：FMT-CA-FFCT组（移植CRC患者粪便的小鼠）和FMT-H-FFCT组（移植健康对照组的粪便）。
(2)技术路线
在进行灌胃之前，所有小鼠均在水中用广谱抗生素混合物2周。这两组患者分别灌胃CRC患者或健康人的粪便悬浮液2周（每周两次），同时灌胃FFCT（2.6 mg/g）2周。在最后一次口服给药24小时后，从小鼠眼球中提取血样，并储存在−80°C，直到分析。
研究结论
1、复方肠泰调节CD4+和CD8+T细胞水平
FFCT治疗对各组肿瘤体积无显著影响（p>0.05），作者使用流式细胞仪分析了免疫细胞（CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞）的水平。结果表明，与CT26组相比，FFCT治疗组脾脏和血液中的CD3+CD4+T细胞显著增加，但两组之间的肿瘤体积没有显著差异。与CT26组相比，CT26H组脾脏的CD3+CD8+T细胞增加，但两组之间的血液和肿瘤没有显著差异。这些结果表明，FFCT可能通过提高血液和脾脏中CD3+CD8+和CD3+CD4+T细胞的水平来增强机体免疫力。
图1 | CT26组和FFCT治疗组的肿瘤体积和淋巴细胞百分比
2.复方肠泰对结直肠癌荷瘤小鼠肠道菌群的影响
使用微生物16s RNA基因测序分析不同组的肠道微生物组。分析结果表明，荷瘤小鼠与健康小鼠的GM存在显著差异。对于CT26组和PBS组，两组之间的肠道微生物群落聚集明显不同（Adonis，p<0.05）。对于CT26组和PBS组，丰度等级曲线（补充图S3B）表明，PBS组的群落相似性高于CT26组。图2D中的数据显示，两组（CT26组和PBS组）的GM组成为要特征为厚壁菌、拟杆菌、变形杆菌、TM7和脱壁菌。两组动物门的分布存在显著差异。PBS组的厚壁菌和脱壁菌的丰度高于CT26组（p<0.05），而拟杆菌和放线菌的丰富度则较低（p<0.05）。如图所示，两个组的物种组成也有很大差异。
图2 | CT26组和PBS组之间的GM差异
3.肿瘤引起的肠道微生物失调对复方肠泰代谢物的影响
对荷瘤小鼠（CT26H组）和健康小鼠（CM组）使用高剂量FFCT（2.6 mg/g），运用血清代谢组学比较两组之间的血清代谢物。在CT26H组和CM组之间发现了243种不同的代谢物。富集前50种差异代谢物和KEGG途径如图3C、D所示。结合网络检索，苦参碱、异姜烯酮B和亮菌素主要与中医有关，表明肿瘤的存在可能影响FFCT的代谢。数据表明，这些差异代谢物涉及多种途径，包括氨酰tRNA生物合成、癌症中的中枢碳代谢、脂肪细胞中脂解的调节、鞘脂信号途径、花生四烯酸代谢、癌症中胆碱代谢和铁沉降等。
图3 | CT26H和CM组的血清代谢组学研究
4.结直肠癌患者肠道菌群失调对复方肠泰代谢产物的影响
结直肠癌荷瘤小鼠的GM紊乱改变了与FFCT相关的血清代谢组。然而，在血清代谢组变化中起关键作用的肠道微生物群或肿瘤尚不清楚。FMT-CA组和FMT-H小鼠使用高剂量的FFCT（2.6 mg/g）比较两组之间的血清代谢，不包括肿瘤因素。PCA图和代谢物强度分布框表明样品相对稳定。如OPLS-DA图所示，两组的样本被清楚地分离，表明两组之间存在一定差异。FMT-H-FFCT组的血清代谢物包括尿酸、茉莉酸、间香豆素酸、胆酸、熊果酸、鹅去氧胆酸、γ-谷氨酰酪氨酸和一些氨基酸高于FMT-CA-FFCT组。结合网络检索，茉莉酸和间香豆酸与中医药有关，表明肠道微生物群可以作为单一因素影响FFCT的代谢。
图4 | FMT小鼠血清代谢的质谱
（A） FMT-CA-FFCT和FMT-H-FFCT组的OPLS-DA评分图；
（B） FMT-CA-FFCT组和FMT-H-FFCT组前50种不同代谢物的热图（p<0.05）；
5.复方肠泰对荷瘤小鼠肠道微生物的改善作用
荷瘤组和健康组的GM和FFCT的血清代谢有很大差异。GM在荷瘤小鼠体内的失调与FFCT相关的血清代谢物较少相对应。微生物16S rRNA基因测序用于检测不同剂量的FFCT对荷瘤小鼠GM的影响，发现FFCT治疗组（CT26L、CT26M、CT26H）的GM组成不同。FFCT治疗组的肠道微生物群落差异性高于CT26组。FFCT治疗组的厚壁菌丰度高于肿瘤组，这与健康组的趋势相似。此外，随着FFCT浓度的增加，厚壁菌的丰度降低。相反，FFCT治疗组的拟杆菌丰度低于肿瘤组，这也显示出与PBS组相似的趋势。CT26M组的拟细菌丰度最低，变形杆菌和放线杆菌丰度最高。
图5 | CT26组和FFCT治疗组之间的GM差异
研究结论
本文通过肠道微生物群检测实验、复方肠泰血清代谢组学实验、粪便微生物群移植实验三个实验以及流式细胞术分析、血清代谢组学分析、肠道微生物群分析、统计分析四个分析发现荷瘤小鼠GM的生态失调降低了与FFCT相关的血清代谢产物，FFCT可以纠正结直肠荷瘤小鼠GM的紊乱，发挥作用。CRC负荷下的转基因生态失调阻断了FFCT的吸收和代谢，说明更健康的肠道微环境有利于FFCT更好的疗效。此外，FFCT还可以纠正CRC个体GM的失衡。本研究通过结合肠道微生物群和血清代谢为FFCT的治疗效果提供了新的视角，为改善CRC患者的GM状态提供了基础，以获得更好的疗效。
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这篇文章以全新的角度阐述了肠道微生物群（GM）与血清代谢的关系，实验以抗肿瘤泰（FFCT）作为结直肠癌（CRC）治疗模型，以FFCT作为中药处方模型，主要通过肠道微生物群检测实验、复方肠泰血清代谢组学实验、粪便微生物群移植实验三个实验以及流式细胞术分析、血清代谢组学分析、肠道微生物群分析、统计分析四个分析清晰明了地分析了实验探究的过程，从而发现了复方肠泰可以改善荷瘤小鼠的肠道微生物群。
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