甲状腺髓样癌（MTC）是一种来源于甲状腺滤泡旁细胞（C细胞）的神经内分泌恶性肿瘤，临床较为罕见。这一疾病具有较高的遗传倾向及复发转移潜能，综合分析其从基因型到表型的异质性有助于作出深入理解。同时，晚期MTC患者治疗选择有限，且面临药物毒性强、耐药风险高等问题，故迫切需要在了解其分子特征的基础上，为该类患者群体提供更为精准的治疗策略。然而，到目前为止仍然缺乏关于MTC的多组学数据以提供较为扎实的研究资源，限制了对这一疾病的进一步认知以及相关深层次研究。
2022年11月8日，复旦大学附属肿瘤医院头颈外科嵇庆海教授、王宇教授、魏文俊副主任医师与西湖大学郭天南教授作为共同通讯作者，在Cell Discovery (IF:38.079) 杂志发表了题为“Integrated proteogenomic characterization of medullary thyroid carcinoma”的研究论文，并被选为了当期亮点文章（Featured Article），该研究全面揭示了甲状腺髓样癌全景蛋白基因组学图谱，并提出了MTC”分子三分型”的概念。
复旦大学附属肿瘤医院头颈外科史潇博士、沈岑楷博士、史荣亮副主任医师、廖天博士，西湖大学孙耀庭博士，浙江省肿瘤医院张艳博士，欧易生物章璠博士为本文共同第一作者。文章中全外显子组、转录组、甲基化组、常规蛋白组和磷酸化蛋白组检测及主要生信分析服务
研究内容
本研究通过全外显子组测序、RNA测序、DNA甲基化芯片、蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析，全面展示了102个MTC患者的多组学全景图谱。综合分析发现，独立于已被证实占据主导致癌作用的RET及RAS基因之外，BRAF和NF1基因是本队列中新发现的MTC驱动基因。另外，研究中基于蛋白质组学深度分析，揭示了异质性明显的三种MTC分子亚型，作者将其分别命名为：代谢型、基底型和间质型。这三种蛋白亚型在遗传驱动因素、表观遗传修饰谱、临床病理因素和临床结果等方面均有显著不同。
此外，本研究又进一步根据多组学分析结果探索并描绘了每种亚型的假定治疗靶点，如预后最差的间质型存在多种已获批或在研酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物靶点表达水平的升高，这些研究结果有助于深入理解此疾病，并有潜力进行后续临床转化。
研究路线
研究结果
1、国际上首个MTC蛋白基因组学全景图谱的绘制
研究队列共包括来自国内五家医院（复旦大学附属肿瘤医院、浙江省肿瘤医院、北大深圳医院、泰州人民医院、常州市第二人民医院）的102例MTC患者组织。整体来说，本研究使用102对MTC患者的组织进行全外显子组测序（肿瘤配对正常甲状腺组织或外周血），再对102例和101例MTC肿瘤进行蛋白质组学和RNA-Seq测序，最后分别对78例和74例MTC组织进行甲基化和磷酸化蛋白质组学测序（图 1a）。基于RNA-Seq数据进行的肿瘤纯度分析显示，本队列样本肿瘤纯度的中位数为91.5%，再行PCA分析后发现五个中心的样本间无明显批次效应，与预期相符（图 1b-d）。
研究证实，相比转录水平，蛋白水平的调控能够更好地反映甲状腺髓样癌的肿瘤异质性及相关基因功能（图 1e-f）。同时，蛋白质丰度和mRNA表达水平间的一致性程度较弱。在对“mRNA-蛋白质”配对行通路富集分析时发现，与氧化磷酸化和mRNA/蛋白质加工相关通路相比，那些参与代谢相关通路的基因具有更强的转录组与蛋白组表达相关性（图 1g-h）。而这一表达相关性随着TNM分期的增加而呈明显下降趋势，表明恶性程度越高的MTC肿瘤内部的转录后调控对生物学行为的影响更强（图 1i）。
图1 | 蛋白基因组研究总结
2、中国MTC患者的驱动突变图谱
综合考虑患者家族史、临床表现及RET胚系突变情况，25位患者（24.5%）可被定义为遗传性甲状腺髓样癌（HMTC），其中包括23例MEN2A（含FMTC）及2例MEN2B，而余下77位患者均可被归为散发性病例（SMTC）（图 2a-b）。存在RETM918T突变的MTC患者人群肿瘤恶性程度显著提升，这一点可从更多的淋巴结转移、更晚的TNM分期以及更差的无解剖复发生存率（SRFS）等三方面体现（图 2c-e）。
在两个不伴任何其他驱动突变的散发性MTC病例中，作者分别检测到了两个非热点BRAF突变——p.G469A和p.T599dup，这两种突变已在其它神经内分泌肿瘤中被证实为驱动突变。蛋白组学分析结果证实它们可不同程度的激活下游致癌信号通路，说明BRAF突变可作为MTC中一个潜在的驱动因素（图 2a, f）。接着作者又发现队列中有一位特殊的MTC患者还同时患有I型神经纤维瘤病（NF1），作者发现，这个患者缺乏常见的MTC驱动基因突变，但他的MTC肿瘤组织却携带从胚胎卵裂过程中产生的NF1基因de novo截短突变。这一突变引发了肿瘤中该基因的转录及翻译水平的急剧下降，使得其抑癌功能失活，进而同时导致了两种疾病的发生（图 2a, g）。综上，本研究验证了RET和RAS突变在MTC中的主导作用，并首次直接证实了BRAF和NF1基因在MTC致病过程中的驱动作用，丰富了甲状腺髓样癌的驱动基因谱。
图2 | 中国MTC队列中的驱动突变景观及其临床病理和下游分子意义
3、蛋白质组学分析描述了MTC全新分子亚型，并于多组学层面上展现了分型间异质性
作者而后针对102个MTC肿瘤样本的蛋白组学共性及异质性展开深入分析，将其最终聚类成三种具有不同分子特征的蛋白质组学分型，包括富集多个细胞代谢相关通路的“代谢型”、具有更高翻译活性且基底因子蛋白表达水平明显升高的“基底型”、细胞外基质（ECM）相关蛋白表达水平及其通路富集程度均出现显著上调的“间质型”（图 3a-d）。作者进一步综合多组学数据分析结果发现，驱动突变、体细胞拷贝数变异和表观遗传修饰共同参与了MTC表型的确定，且整合队列临床病理信息后证实，间质型可能代表了一组侵袭程度更高的肿瘤（图 3e-j）。
综上所述，蛋白三分型间可能存在的差异性促使各亚型多组学特征的深入研究，从而于更深层次上揭示MTC的肿瘤异质性，引发对后续个性化治疗的思考。
图3 | MTC的蛋白质组学分型及其在遗传、表观遗传及临床病理等方面的差异性分析
4、致癌通路激活，细胞周期信号增强以及基因组不稳定性升高可作为代谢型MTC的生物学标志
接下来作者剖析了每个亚型的多组学特征，以探索它们独特的生物学特征。经典ERK级联、 JNK/p38级联、PI3K/Akt/mTOR信号通路以及MAPK信号通路的相关蛋白水平在代谢型中显著增加，同时MAPK通路相关重要成员STMN1在丝氨酸16及46位点上均出现磷酸化水平的升高（图 4a-b）。此外，该亚型表现出细胞周期信号的激活（图 4c-e），且同源重组结构缺陷（HRD）得分更高，说明具有较高的基因组不稳定性（图 4f-g）。上述结果均支持代谢型MTC患者可能从MAPK/PI3K通路抑制剂、细胞周期抑制剂或PARP抑制剂中获益。
图4 | 致癌通路激活、细胞周期信号增强以及基因组不稳定性升高可作为代谢型MTC的生物学标志
5、基底型保留更高程度的神经内分泌特性
基底型中与突触传递过程通路相关的蛋白丰度增加，与分泌蛋白转运和胞吐过程相关的通路和磷酸化蛋白表达水平呈明显上调趋势（图 5a-c）。作者进一步发现，基底型肿瘤中，与对神经递质相关的4个基因（NCAM1，VAMP4，CADM1，CAKML3）的CpG岛甲基化程度对mRNA表达水平及蛋白丰度的影响呈现负调节顺式效应。激酶-底物富集分析发现，CAMK2B自磷酸化在基底型MTC的发展过程中具有潜在推进作用（图 5d-e）。同时，综合转录组和蛋白组数据可以得知，几乎所有MTC特异性或广谱的神经内分泌肿瘤标志物都在基底型中显著上调（图 5f）。令人惊喜的是，根据蛋白表达水平和临床药物可及性情况来看，CEACAM5可能是基底型肿瘤的候选治疗靶点（图 5g）。
图5 | 基底型的蛋白基因组分析揭示了更高程度的神经内分泌特性
6、间质型MTC中可找到酪氨酸激酶抑制剂候选生物标志物及已有靶点的显著富集
在间质型MTC中，超过四分之一的基质蛋白显著上调，其中腱蛋白家族成员TNC和TNXB明显富集（图 6a）。TNC是RETM918T突变所驱动的MTC肿瘤中上调最为明显的一种基质蛋白，其表达水平与间充质肿瘤中经典干性标志物PROM1呈正相关，同时较高的TNC或TNXB表达也预测了更差的预后（图 6b-d）。值得注意的是，间质型MTC中血管生成相关STAT3信号通路的活性明显增强，关键的血管生成因子PDGFRB和VEGFR1的表达水平也显著上调，它们是MTC已获批药物卡博替尼（FDA）和安罗替尼（中国大陆）最为重要的抗癌靶点，也是多种酪氨酸激酶抑制剂（MTC在研药物）的靶点（图 6e-f）。此外，该研究的转录组数据显示间质型MTC具有较高的CSF1R转录水平（图 6g）。
值得说明的是，CSF1R是国产原研TKI药物索凡替尼抑制肿瘤相关巨噬细胞极化的重要靶点，并且，本文通信作者嵇庆海教授前期牵头的一项II期临床试验表明，索凡替尼在一部分局晚或转移性MTC患者中显示出了良好疗效。综上，间质型MTC患者是以上几种获批或在研靶向药物最有希望的获益群体。
图6 | 间质型的蛋白基因组分析揭示了TKIs候选生物标志物及已有靶点的显著富集
研究结论
作者通过全面多组学综合分析，发现MTC新的潜在驱动基因，并提出分子异质性明显的三种MTC蛋白质组亚型——代谢型、基底型和间质型，在分析每个亚型典型特征的基础上探索假定治疗靶点。
本研究提供了迄今为止最大、最全面的MTC多组学分析数据，极大的拓宽了研究者对MTC生物学特征及肿瘤异质性的理解，并在提出治疗假设的同时服务于后续临床转化，为这种相对罕见肿瘤的临床前研究及临床试验打下基础、为本研究领域提供了大量宝贵的研究资源。
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