前言
结直肠癌 (CRC) 是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，位居全球恶性肿瘤发病率第三。目前已有证据表明术后放疗可以减少局部复发、提高生存率。然而，在临床实践中，对放疗敏感性的个体差异很大，因此寻找新的生物标志物来预测放疗敏感性，制定个性化策略具有十分重要的意义。
2022年8月17日，苏州大学附属第三医院（常州市第一人民医院）蒋敬庭教授为通讯作者，在Cell Death Differentiation(IF: 12.067)杂志上在线发表题为“A novel long noncoding RNA SP100-AS1 induces radioresistance of colorectal cancer via sponging miR-622 and stabilizing ATG3”的研究论文，发现了lncRNA SP100-AS1在调节CRC细胞增殖和放射敏感性中的作用，为探索CRC潜在的生物标志物及其可能的调控机制提供参考。
技术路线
研究结果
1、SP100-AS1上调表达与CRC放疗抵抗相关
通过全转录组测序分析了放疗敏感和放疗抵抗患者的lncRNA表达谱变化，发现lncRNA SP100-AS1在放疗抵抗患者中显著高表达(图 1)。与正常上皮细胞系相比，SP100-AS1在CRC细胞系中显著高表达，尤其是HCT116和SW480。此外发现SP100-AS1高表达的CRC患者的总生存率偏低(图 1)。综上所述，lncRNA SP100-AS1高表达与CRC患者的放疗抵抗和低生存率相关。
图1 | SP100-AS1在结直肠癌中高表达
2、SP100-AS1敲除增强了CRC的放疗敏感性
作者探究了SP100-AS1对CRC细胞增殖和放疗敏感性的影响。抑制SP100-AS1表达时，HCT116和SW480细胞的放疗敏感性显著增加，细胞增殖水平和细胞活力显著下降，并且诱导了DNA损伤的重要标志物 γ-H2AX的表达，显著增加了HCT116细胞的凋亡(图 2)。SP100-AS1参与了辐射诱导的DNA损伤和细胞凋亡，且SP100-AS1敲除可提高CRC的放疗敏感性。
图2 | SP100-AS1敲除加剧了放疗诱导的细胞死亡
3、SP100-AS1在体内具有显著的放疗抵抗性
裸鼠移植瘤实验表明，SP100-AS1敲除的HCT116细胞生长较慢，且在2 Gy辐射下，SP100-AS1敲除的HCT116细胞生长更为缓慢(图 3)。在2 Gy辐射下，敲除SP100-AS1会诱导更严重的DNA损伤，表明SP100-AS1敲除抑制了CRC肿瘤细胞的生长，特别是在辐射暴露下(图 3)。综上，SP100-AS1敲除可以提高CRC的体内外放疗敏感性。
图 3 | SP100-AS1敲除抑制CRC细胞生长
4、SP100-AS1通过自噬途径增加结肠直肠癌细胞的放疗抵抗活性
为了探究自噬途径是否参与了抗辐射过程，作者分析了LC3-II和p62/SQSTM1等蛋白在敲除SP100-AS1细胞系中的表达情况。敲除SP100-AS1后，LC3-II表达下调，p62表达上调；放疗处理后，LC3-II表达下调，p62表达上调，说明自噬作用明显减弱(图 4)。WB和IHC分析表明，IR治疗后的CRC移植瘤中p62表达显著降低，LC3-II表达显著升高，而SP100-AS1敲除逆转了这一趋势。综上，辐射可以诱导HCT116细胞的自噬，而敲除SP100-AS1则可以缓解这一作用。
图4 | SP100-AS1通过自噬调控HCT116细胞增殖
5、SP100-AS1通过ATG5和Beclin1调控自噬通路
有报道称ATG5和Beclin1可直接激活自噬信号通路，因此作者探究了过表达ATG5和Beclin1能否挽救SP100-AS1介导的自噬。回复实验表明：因SP100-AS1敲除所诱导的自噬下调可以通过上调ATG5或Beclin1来挽救(图 5)。此外，上调ATG5和Beclin1，可以降低SP100-AS1敲除诱导的细胞凋亡(图 5)。这些结果表明，ATG5或Beclin1的上调，都可以挽救因SP100-AS1下调导致的细胞增殖下降。
图5 | 过表达ATG5和Beclin1均挽救了SP100-AS1介导的自噬
6、SP100-AS1与ATG3相互作用并调节其蛋白稳定性
通过质谱鉴定和pull-down找到了一个可以与SP100-AS1特异性结合的蛋白ATG3(图6)。有研究表明蛋白质的稳定性会受到泛素化依赖的蛋白酶体降解信号通路的调控，因此作者探究了SP100-AS1是否通过泛素化依赖的蛋白酶体通路调控ATG3的稳定性。发现SP100-AS1敲除增加了ATG3的泛素化水平从而介导ATG3的降解，表明SP100-AS1通过泛素化介导ATG3的降解(图 6)。上述结果表明了SP100-AS1可以与ATG3特异互作来调控其蛋白稳定性。
图6 | SP100-AS1与ATG3相互作用来调节其蛋白稳定性
7、SP100-AS1可以与miR-622靶向结合来发挥其调控作用
为了进一步研究SP100-AS1调控ATG3表达的机制，作者观察了SP100-AS1是否可以作为ATG3 mRNA的miRNA海绵来发挥其调控作用。在HCT116和SW480细胞系中均检测到AGO2和SP100-AS1互作，同时发现SP100-AS1可以与miR-622互作，且突变的SP100-AS1 3‘UTR不能与miR-622相互作用(图 7)。以上结果表明SP100-AS1可以作为miR-622海绵发挥作用。证实了miR-622可以直接与SP100-AS1靶向结合，并影响其在CRC细胞中的mRNA 稳定性。
图7 | SP100-AS1作为miR-622的海绵发挥作用
8、miR-622靶向ATG3 mRNA调节自噬
作者继续探究了miR-622对自噬通路的影响。发现SP100-AS1过表达后，p62的表达下调，LC3-II的表达上调，而miR-622过表达后则相反。在SP100-AS1过表达的细胞系中异位表达miR-622，可恢复p62和LC3-11的表达(图 8)。因此作者猜测SP100-AS1可以作为miR-622的海绵，阻止其对ATG3 mRNA的影响，从而稳定ATG3表达，促进自噬。为了验证这一猜想，进行了一系列试验。发现过表达miR-622可以降低WT荧光素酶的表达，而与SP100-AS1共转染则可以挽救荧光素酶的活性，且共转染携带突变的ATG3 3‘UTR区域的质粒并不能恢复荧光素酶活性。此外，miR-622显著降低了ATG3的表达，而与SP100-AS1共表达可以恢复ATG3的表达，敲除SP100-AS1也可以降低ATG3中mRNA的水平(图 8)。证实SP100-AS1是CRC放疗抵抗的关键调控因子，作为miR-622的海绵，维持ATG3的稳定表达。
图8 | SP100-AS1通过与miR-622相互作用调控ATG3的表达
研究结论
本研究通过全转录组测序分析，在放疗抵抗的CRC患者组织中找到表达上调的lncRNA SP100-AS1，敲除SP100-AS1会显著降低体外和体内的放疗抵抗、细胞增殖和肿瘤形成。采用质谱和生信分析发现与SP100-AS1互作的特异蛋白ATG3及miRNA miR-622。此外，研究发现SP100-AS1通过泛素化依赖的蛋白酶体途径可以与ATG3蛋白互作并稳定其表达，同时还可以作为miR-622的海绵，靶向ATG3 mRNA，影响自噬活性。综上所述，本研究表明SP100-AS1/miR-622/ATG3调控CRC的放疗抵抗和自噬活性。
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