前言
在短短二十年的时间里，血管生成在伤口愈合、各种癌症、神经缺损、血管损伤和几种眼科疾病的治疗中的中心作用已变得明显。延胡索乙素作为延胡索的指标成分，与保护心血管系统密不可分，但其在血管生成中的作用尚不明确。
本篇由北京中医药大学雷海民教授课题组等联合在Pharmacological Research期刊发表了题为“Tetrahydropalmatine triggers angiogenesis via regulation of arginine biosynthesis”（IF：10.334）的研究成果，通过基于DESI-MSI空间代谢组学、GC–MS代谢组学研究方法，发现延胡索乙素通过调节精氨酸的生物合成触发血管生成，有可能发展成为满足临床需求的药物。
研究背景
血管生成是内皮细胞形成新血管的过程，是血管内皮生长因子（VEGF）在运动或缺血时对营养素或缺氧的适应性反应。在短短二十年的时间里，血管生成在伤口愈合、神经缺损、血管损伤、癌症和几种眼科疾病的治疗中的中心作用已变得明显。
延胡索乙素是延胡索的指标成分，具有显著的镇静、催眠和镇痛作用。延胡索乙素可以阻断钙通道，抑制病原菌和条件反射，保护脑组织和心血管系统。延胡索乙素还显著抑制CaSr/PLCγ1通路，并保护辐射诱导的肺血管内皮细胞凋亡，因此延胡索乙素对触发血管生成有着重要作用。但是，延胡索乙素对血管生成的作用及其潜在作用尚不清楚。
长期以来，人们忽视了血管生成是否受到代谢“开关”的影响。重要的是，内皮细胞代谢有助于血管发育，促进血运重建或为促/抗血管生成策略提供新的机会。作者之前已经根据中医临床经验，通过分子对接证明了延胡索乙素和VEGFR2的结合潜力。在此，作者通过药理试验和基于DESI-MSI空间代谢组学、GC-MS非靶向代谢组学，在体内鸡胚绒毛尿囊膜和体外多种内皮细胞模型中确定了延胡索乙素作为促血管生成的触发因子。
研究思路
研究方法
1. 实验分组
体内：对照组、天麻素组（阳性药物对照）和延胡索乙素组
体外：对照组、模型组、天麻素组和延胡索乙素组
2. 技术路线
2.1. 体内鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验
2.2. 体外增殖、成管、划痕愈伤实验
2.3. DESI-MSI空间代谢组学、GC-MS代谢组学分析
研究结论
1. 分子对接和研究构架图
分子对接显示延胡索乙素可以和VEGFR2对接良好。
图1 | 通过经典药理学试验和代谢组学揭示延胡索乙素对血管生成的作用
2. 延胡索乙素以剂量依赖性方式诱导血管生成
按照图2A进行鸡胚绒毛尿囊膜实验，设置对照组、不同浓度的延胡索乙素组和天麻素（gastrodin）组，其中天麻素是阳性对照药物。与对照组相比，对不同组的鸡胚绒毛尿囊膜样本进行的宏观观察表明：延胡索乙素和天麻素的促血管生成作用主要表现为血管数量和血管面积增加（图2B-C），延胡索乙素的浓度越大血管生成越明显。通过PCR检测发现延胡索乙素（呈浓度依赖性）和天麻素促进VEGFR2的mRNA水平。
图2 | 延胡索乙素呈浓度依赖性诱导体内血管生成
3. 延胡索乙素促进体外增殖、试管形成和迁移
根据MTT的结果确定延胡索乙素的最佳体外浓度为20、40、80μM（图3A）。同样以天麻素（80μM）作为阳性对照药物。使用H2O2（7.2μM for 12 h、3.6μM for 12 h）、t-BHP（11μM for 4 h、5.5μM for 4 h）和oxLDL（320μM for 12 h）造成不同的细胞损伤（图3B），并确定t-BHP（15.5μM for 4 h）作为后续实验条件。结果显示，与对照细胞相比，延胡索乙素呈浓度依赖性恢复细胞活力（图3B）、促进成管（图3C-D）、促进划痕愈合（图3E-F）。
图3 | 延胡索乙素呈浓度依赖性诱导体外血管生成
4. 非靶向代谢组学揭示了延胡索乙素调节的代谢途径的改变
使用基于DESI-MSI空间代谢组学以及GC-MS非靶向代谢组学揭示代谢途径的改变，图4A-B分别为主成分分析（PCA）结果和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）结果（横坐标表示主要成分的得分值，用于分辨组间差异；纵坐标表示正交成分的得分值，用于分辨组内差异）。使用OPLS-DA模型的投影变量重要性（VIP）值和S-plot图选择候选生物标记物（图4C），最后共鉴定出8个潜在的生物标志物（表1）。使用MetaboAnalyst进行通路分析，精氨酸生物合成被认为是延胡索乙素调节的主要通路（表2）。
图4 | 使用DESI-MSI空间代谢组学鉴定延胡索乙素调节的生物标志物和改变的代谢途径
随后应用基于GC-MS非靶向代谢组学进一步揭示代谢途径的改变，图5A-C分别为PCA结果（含对照组、模型组和延胡索乙素组）和OPLS-DA结果（B为对照组和模型组、C为模型组和延胡索乙素组）。使用OPLS-DA模型的VIP值和S-plot图选择候选生物标记物，最后在对照组和模型组共鉴定出6个潜在的生物标志物（图5D，表3），在模型组和延胡索乙素组共鉴定出1个生物标志物（图5E，表3）。使用MetaboAnalyst进行通路分析，精氨酸生物合成同样被认为是延胡索乙素调节的主要通路（表4）。
图5 | 使用GC-MS代谢组学鉴定延胡索乙素调节的生物标志物和改变的代谢途径
5. 延胡索乙素对精氨酸生物合成的机制验证
为了验证延胡索乙素的机制，通过基于DESI-MSI空间代谢组学和基于GC-MS的靶向代谢组学以及药理学分析测定与精氨酸生物合成相关的指标。结果显示，与对照组相比，延胡索乙素降低瓜氨酸（图6A，表5，表6）和精氨酸琥珀酸合成酶（图6B）、升高一氧化氮（图6C），但不影响精氨酸（图6A，表5，表6）。体外细胞实验显示与对照组和模型组相比，延胡索乙素降低延胡索酸（图6D）和精氨酸（图6E）并升高VEGFR2蛋白水平（图6F）。同时，延胡索乙素显著降低t-BHP引起的氧化应激（细胞损伤）（图6G）。
图6 | 延胡索乙素对精氨酸生物合成的作用机制
相关讨论
延胡索乙素对精氨酸生物合成和内皮VEGFR2表达的影响，从而促进血管生成（图7）。延胡索乙素在血管生成中的作用机制有两个方面。首先，根据中医理论，延胡索是一种活血化瘀药，用于治疗创伤愈合、神经缺损和血管损伤等异常血管生成相关疾病。作为延胡索水提物的指标成分，作者证明，延胡索乙素可以显著抑制瓜氨酸、延胡索酸、精氨酸琥珀酸合成酶，并刺激精氨酸，然后持续释放NO、增强VEGFR2表达、促进血管生成和血管保护。此外，虽然延胡索乙素可以在体内或体外激活精氨酸生物合成和VEGF表达，但体内哪些细胞类型对延胡索乙素的促血管生成作用至关重要，仍有待确认。这些数据表明延胡索乙素是一种潜在的促血管生成先导化合物，可用于未满足的临床需求。尽管精氨酸生物合成增强VEGFR2功能的机制仍有待阐明，但这篇手稿表明，瓜氨酸到精氨酸的流量是血管生成调节中的一个关键轴，这有可能发展成为新的治疗方法和药物，以减轻氧化应激诱导的血管健康损害或病理变化。
研究结论
通过药理学试验和基于DESI-MSI空间代谢组、GC-MS非靶向代谢组学确定了延胡索乙素是通过调节精氨酸生物合成的促血管生成触发物。延胡索乙素可以依次影响瓜氨酸到精氨酸的流量、精氨酸生物合成和内皮VEGFR2的表达，从而促进血管生成。这些结果表明延胡索乙素是潜在的促血管生成先导化合物。
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中药/单体的机制研究一直存在难点。该研究利用两种不同的代谢组学方法（DESI-MSI空间代谢组/GC-MS代谢组学）确定了延胡索乙素对代谢的影响，除了两种不同的代谢组学分析结果可以相互映证外，还通过体内、体外的药理学实验进行了验证。该研究为延胡索乙素的促血管生成机制提供了全新的机制，同时为中药/单体的代谢组学机制研究提供了范本。
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