本期文献解读我们分享一篇2020年2月发表在《Nature Immunology》（IF 25.604）上的人类结肠单细胞测序结合肠道微生物测序的文章，一同学习单细胞测序结合微生物测序的文章思路和“不同部位结肠细胞及微生物异质性与免疫微环境的关系”。下面我们一起学习这篇文章的具体内容。
材料：12例肠系膜淋巴结、盲肠、横结肠、乙状结肠组织
期刊：Nature Immunology
发表时间：2020年2月
方法：10× Genomics scRNA-seq，16S rRNA、单细胞转录组测序
研究背景和研究目的
结肠作为一种屏障组织，有其独特的免疫环境，结肠中的免疫细胞对多种多样的微生物群落具有耐受性。肠道内不同部位营养物质和氧气的获得程度、管腔内容物的转运速率和区域化的宿主免疫活性决定了微生物群在空间上的组成具有多样性。微生物群对人体健康至关重要，共生菌和致病微生物的不平衡与许多疾病相关。因此，这篇文章旨在利用单细胞转录组测序更加深入地了解肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes，MLNs）及结肠不同部位免疫细胞的多样性与结肠微生物群之间的稳态关系，帮助我们全面理解人结肠近端到远端不同区域免疫细胞的比例和激活状态的差异，并将这些差异与不断变化的微生物群落联系起来，为未来研究不同肠道疾病（如克罗恩病和溃疡性结肠炎）对肠道特定区域具有偏好性的发病机制提供参考。
内容概述
作者采集了不同部位肠粘膜微生物样本进行16S rRNA测序，发现结肠区域从近端到远端微生物组成具有多样性。为了进一步探究结肠微生物多样性是否伴随着结肠不同区域免疫细胞的差异，作者从5名捐赠者的MLNs、盲肠、横结肠和乙状结肠中共分离出41650个免疫细胞进行测序，构建了不同结肠部位免疫细胞的单细胞图谱。对免疫细胞的分析发现，辅助T细胞、调节性T细胞和B细胞的激活和迁移具有区域差异性。
具体研究内容解析
1. 不同的结肠区域微生物组成不同
作者取12名遗体捐赠者盲肠、横结肠和乙状结肠粘膜表面的拭子进行了16S rRNA测序，绘制结肠粘膜表面的细菌组成图（Figure 1a）。主要的肠道菌门类杆菌、厚壁菌、变形菌和放线菌遍布每个供体的肠道（Figure 1b）。在微生物组成上观察到乙状结肠中类杆菌更为普遍（Figure 1c）。此外，肠球菌在近端结肠中更为普遍，而大肠杆菌和志贺菌在远端结肠中更为丰富（Figure 1b，c）。
Figure 1. 结肠近端至远端微生物组成的差异变化
2. 构建MLNs、盲肠、横结肠、乙状结肠组织的免疫细胞图谱
作者从5名捐赠者的正常结肠组织分离41650个免疫细胞进行后续分析，降维聚类后根据各类细胞marker（Figure 2b）将所有细胞鉴定为25种细胞类群：滤泡和记忆B细胞、IgA和IgG浆细胞、效应和记忆CD4 T细胞、T细胞、CD8 T细胞、γδT细胞、ILC、NKT、肥大细胞和髓系细胞（Figure 2a）。为了确定结肠近端至远端区域免疫细胞的差异，对四类组织样本中CD4 T细胞亚型比例（Figure 2c），B细胞亚型和非CD4 T细胞免疫细胞比例（Figure 2d）进行比较，发现T细胞和B细胞的活化和记忆状态在结肠和MLNs之间存在显著差异。
此外，作者还发现T17和T1细胞的相对比例呈倒梯度变化，其中T17细胞主要存在于盲肠中，其次为横结肠、乙状结肠；T1细胞则相反，在乙状结肠中更丰富（Figure 2c）。结肠T17细胞和T1细胞的这种明显分布与微生物群落的空间变化是一致的，暗示了这两个种群之间的关系。
Figure 2. 结肠稳态中的免疫细胞图谱
3. 结肠不同区域辅助T细胞具有区域特异性转录图谱
为了更全面地了解不同区域CD4效应T细胞，作者首先对不同结肠组织之间的T1和T17细胞进行相关性分析，发现盲肠、横结肠、乙状结肠组织CD4效应T细胞亚型之间具有转录相似性，而MLNs与周围组织的差异则较大（Figure 3a）。三种结肠组织中CD4效应T细胞的差异基因表达分析显示，近端结肠中TANK分子高表达，而乙状结肠中KLF2高表达（Figure 3b）。
接下来，作者研究了T1与T17细胞之间的克隆关系。通过对TCR序列进行分析，发现T1和T17亚型之间共享克隆群，说明CD4 T细胞发挥效应作用是在初始激活之后再决定的（Figure 3c，d）。此外，观察到乙状结肠中的T1细胞和盲肠中的T17细胞克隆扩增最多（Figure 3d），这与该组织中的细胞亚型丰富度一致。同时发现，T1和T17部分克隆之间克隆位点共享（Figure 3d），这表明辅助性T细胞克隆传播到结肠的远端区域。这些结果表明，在近端结肠和乙状结肠的T1和T17细胞中，与激活和组织迁移相关的区域特异性转录具有差异性。
Figure 3. 结肠中辅助T细胞的传播具有区域特异性转录图谱
4. 结肠CD4 T细胞的活化轨迹
鉴于T细胞在平衡其他CD4 T细胞亚群的免疫活动中发挥重要作用，作者对T细胞进行了进一步研究。在不同结肠区域中，T细胞的相对比例在结肠近端到远端中没有明显变化（Figure 2c），因此作者对不同区域T细胞的转录是否具有不同的激活状态或功能进行了探讨。结果发现MLNs中的T细胞亚群主要为中央T细胞和效应T细胞，而结肠中T细胞主要聚集成三个群：KLRB1 T、非淋巴组织T细胞、淋巴组织样T细胞（Figure 4a），这些亚群的比例在结肠区域之间基本一致（Figure 4b）。
作者推测，淋巴组织样T细胞可能从MLNs进入结肠组织的。作者利用拟时序分析探究T细胞的迁移轨迹，结果发现T细胞沿MLNs中静息态的中央T细胞到结肠中具有高度调节性T细胞的轨迹排列（Figure 4c）。同时对该迁移轨迹中的T细胞基因表达变化进行分析，发现拟时序开始时表达的基因包括SELL、CCR7和CXCR4，在拟时序末端，高表达基因为FOXP3、IL2RA、CTLA4、IL10和LAG3（Figure 4c）。
Figure 4. T活化途径——淋巴组织到周围组织
5. 结肠中B细胞呈现出近端至远端激活的梯度变化
接下来作者对不同结肠区域的B细胞进行更深入地分析。对不同结肠区域浆细胞的转录谱进行比较，发现乙状结肠浆细胞更高表达CD27（Figure 5a），并且通过实验验证了CD27的表达差异（Figure 5b）。接下来作者对BCR序列进行分析，发现MLNs中记忆细胞表达IgA1和IgM，结肠浆细胞主要表达IgA2（Figure 5c）。此外，重链可变区的突变频率在浆细胞中最高，其次是记忆B细胞，这表明与原始卵泡B细胞相比，这些细胞类型的体细胞突变更多（Figure 5d）。此外，乙状结肠IgA浆细胞的突变频率显著增加（Figure 5e）。
作者还对克隆相关B细胞进行鉴定以探索整个肠道不同细胞群的克隆扩增动力学，结果发现在记忆B细胞、IgA和IgG浆细胞中克隆扩增明显（Figure 5f）。类似于T细胞，作者发现许多B细胞克隆在所有三个结肠区域之间共享（Figure 5g），这表明B细胞在结肠中传播。对整个组织中提取的批量BCR进行了测序（BCR-seq），与盲肠和横结肠相比，乙状结肠B细胞克隆变异性的增加反映在BCR可变链表达的更大范围内，这表明远端结肠比近端结肠的体液免疫反应更为活跃。
Figure 5. B细胞在乙状结肠中更丰富，克隆扩增更多以及突变频率更高
6. IgA响应乙状结肠中丰富的微生物群落
由于IgA由浆细胞分泌并对特定细菌种类发生反应，作者进一步探究乙状结肠中的浆细胞活化增加与细菌种类的差异。对供体微生物组样本中细菌的IgA作用进行研究（Figure 6a）。发现与盲肠和横结肠的细菌相比，来自乙状结肠的细菌更大比例与IgA结合呈阳性（Figure 6b）。此外， IgA调理菌的散弹枪测序显示，在乙状结肠中有丰富的物种群落（Figure 6c），但是乙状结肠中IgA结合细菌的多样性低于盲肠（Figure 6d）。这些结果表明，与盲肠相比，乙状结肠的IgA浆细胞对丰富且不均匀的细菌群落有反应，这可能是它们的激活状态增加、强归巢到结肠并趋向于更多克隆多样性的原因。
Figure 6. 乙状结肠中抗体识别的微生物群数量增加
研究结论
作者通过单细胞scRNA-seq和微生物16S rRNA数据进行结合，分析了在稳态下肠道内区域适应性免疫细胞组成和功能方面的重要性，区域适应性免疫细胞的变化与微生物群落组成差异之间具有一致性，这些免疫细胞和微生物在结肠稳定状态下的区域特异性可能为理解不同肠道趋向性的机制提供了一个平台。
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