前言
膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一。新辅助化疗（NAC）和根治性膀胱切除术（RC）是肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）的标准治疗方法，但由于具预后不良从而导致治疗效果不佳。最近研究表明，新辅助免疫及联合治疗不仅能改善膀胱癌预后，且利于保膀胱治疗的实施从而提高患者生活质量。但目前，由于对MIBC患者治疗的3种方式——新辅助化疗、新辅助免疫治疗（NICB）、新辅助免疫联合化疗（NAC.NICB）还没有正面的对比研究，以及联合治疗在不能切除或转移性的MIBC患者中作用的不确定性，再加上NICB治疗疗效缺乏可靠的生物标志物等因素。该研究通过平行比较NAC、NICB和NAC.NICB三者治疗的疗效及安全性，开发疗效预测模型，并通过单细胞测序来探索了膀胱癌免疫治疗耐药机制。
2022年10月12日，湘雅医院泌尿外科祖雄兵主任团队领衔的膀胱癌新辅助治疗多中心协作组临床研究成果发表于《Cell》子刊《Cell Reports Medicine》（IF:16.988），以原创性论著形式在线发表题为“Neoadjuvant immunotherapy, chemotherapy, and combination therapy in muscle-invasive bladder cancer: A multi-center real-world retrospective study”的膀胱癌新辅助治疗原创性成果。
期刊：Cell Reports Medicine
影响因子：16.988
发表年月：2022.10.12
材料：3个人膀胱癌样本
方法：10×Genomics scRNA-seq
研究结果
Result 1 评价三种新辅助治疗的疗效和安全性
新辅助治疗分组如图1所示。包括两个阶段的患者，共计253名患者：发现阶段（NAC.NICB=30; NAC:53; NICB:21）和验证阶段（NAC.NICB=68; NAC:54; NICB:27）。
随后，在现实环境中评价三种新辅助治疗的疗效和安全性。对所有253名患者进行病理分期评估和疗效结果总结（表1）。结果显示，50名患者（19.8%）表示得到完全响应，72名患者（28.5%）表示得到部分响应。总体病理下降率和疾病控制率分别为48.2%和87.7%。31名患者（12.3%）出现进展性疾病。其中，NAC.NICB列队的完全响应率显著高于其余两列队，同样，NAC.NICB列队的病理学下降率显著高于其余两列队。
图1 | 患者选择流程
表1 | 三种新佐剂方案的病理反应
Result 2 临床病理特征与病理反应的关系
在这里，由于NAC.NICB列队具有最高的完全响应率和病理反应率，因此作者通过关注NAC.NICB列队筛选生物标志物来预测治疗反应。通过对共有的28名患者在发现阶段有足明显的临床病理特征进行分析，发现较低的临床阶段（p=0.018），尿路上皮癌组织学（p=0.016）、较高血红蛋白（p=0.019）、较低血小板（p=0.044）、较低球蛋白（p=0.034）和较低淋巴细胞的比值（p=0.016）都与较高病理反应率有显著相关。
表2 | 发现阶段NAC.NICB队列病理反应相关因素的单变量分析
Result 3 基于NAC.NICB中纯预处理临床特征的病理反应预测模型的开发和验证
先前发现5种纯预处理临床特征，包括临床分期和4种血液学特征，与病理反应显著相关。接着，作者通过拟合模型，发现四种血液学特征之间存在明显的线性关系（图2A）。根据这四项指标与病理反应的关系，将其整合到新的指标中，并定义为PLR.GHR（PLR*球蛋白/血红蛋白）。结果显示，非应答者的PLR.GHR显著高于应答者（图2B），且PLR.GHR相较于其他四个指标具有更高的病理反应预测的准确度（图2C）。随后，作者将临床分期和PLR.GHR合并转化为线性回归模型，建立病理反应预测列线图（图2D），计算所有患者的反应得分。结果显示，列线图的引导AUC为0.95时，高于临床阶段（AUC=0.77）和PLR.GHR（AUC=0.80）(图2F），校准曲线和决策曲线分析充分的验证了列线图的统计性能及准确性（图2J-K）。
图2 | 在NAC.NICB中开发和验证病理反应预测列线图
Result 4 单细胞测序探究NICB中潜在的生物标记物
为了进一步挖掘NICB的有效生物标记物，通过对来自NICB队列的两个反应样品和一个抗性样品进行了scRNA-seq。结果显示，共检测到有16，298个单细胞被分类为17个簇（图3）。这些簇进一步定义为七种细胞类型，包括膀胱癌上皮细胞，内皮细胞，T / NK细胞，骨髓细胞，B细胞，成纤维细胞等。其中，癌细胞和T/NK细胞在反应组和抗性组之间细胞比例的差异较大（图3L-M），所以癌细胞和T/NK细胞可能是膀胱癌中NICB反应的决定因素。因此，作者将T / NK细胞进一步分为三个亚组，包括CD8 T细胞，CD4 T细胞和NK细胞（图4A-J）。NICB抗性组的T / NK细胞数量小于NICB反应组的数量（图4K）。特别是， NICB组中CD8 T细胞和NK细胞的比例较低（图4L），突出了CD8 T细胞和NK细胞对NICB响应的关键作用。
图3 | 识别细胞类型并比较反应组和抗性组之间细胞比例的差异
图4 | NICB队列中T／NK细胞的重新聚集
为了探究膀胱癌细胞的异质性，作者由进一步将它们分为五个亚型，并探究了其基因表达功能。结果显示，subcluster 0的功能主要在中性粒细胞相关途径中富集，subcluster 1的功能在RNA分解代谢相关途径中富集（图5C），subcluster 2和subcluster 3的功能在RNA剪接相关途径中富集（图5D和5E），subcluster 4的功能在细胞周期相关途径中富集。因此，作者根据功能不同将5个subcluster进一步划分为4个subcluster并进行了定义, 包括中性粒细胞亚型，RNA分解代谢亚型，RNA剪接亚型和细胞周期亚型。其中，细胞周期亚型是NICB反应组中唯一的细胞亚型（图5H），说明subcluster 4具有特殊的异质性，可能是一种特殊的癌细胞。此外，作者也证明了几个关键的免疫相关途径，如抗原处理和呈递、趋化因子相关途径和T细胞相关途径，在细胞周期亚型中显著富集，这与先前的研究结果一致：细胞周期相关途径的异常变化可能会增加肿瘤微环境中肿瘤突变负荷和新抗原的水平，从而增加肿瘤免疫原性和对免疫治疗的敏感性。总之，在这里作者通过从scRNA-seq水平上确定了一组“细胞周期亚型”膀胱癌细胞，该亚型细胞是NICB疗效的积极决定因素。
图5 | 膀胱癌细胞亚群聚类
文章总结
本文作者通过在相同的实际临床实践环境中，比较了新辅助联合疗法（tislelizumab + GC）与单独的新辅助化疗和新辅助免疫治疗，获得了最高的完全响应率和病理下降率。表明新辅助化学免疫疗法可以安全地用于肌肉浸润性膀胱癌患者，同时开发并验证了疗效预测模型，以帮助确定接受新辅助化学免疫治疗的候选者。作者通过单细胞测序技术来进一步挖掘NICB的功效生物标记物，发现CD8 T细胞和NK细胞对NICB响应的关键作用。其中，“细胞周期亚型”膀胱癌细胞对NICB疗效有着积极的影响。综上，本文开发并验证了新辅助化学免疫疗效预测模型，构建了基于NICB治疗单细胞转录组图谱，为解析膀胱癌细胞的亚群及探究NICB中潜在的功效生物标记物提供了宝贵经验。
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