2023年8月23日，南京大学吕瑛、陈迪俊、邹晓平及闫超共同通讯在Nature Communications杂志（IF=16.6）发表题为“Single cell transcriptomic analyses implicate an immunosuppressive tumor microenvironment in pancreatic cancer liver metastasis”的研究论文，本研究通过scRNA-seq技术探索胰腺导管腺癌的转移机制，为开发转移性个体化治疗提供思路。
发表期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
文章技术：单细胞转录组测序
胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高度转移性疾病，所有靶向和免疫治疗都难以治疗。PDAC通常在晚期才被发现，对现有的治疗方法有很强的抵抗力，部分原因是在最初诊断时远处转移的发生率极高(>80%)，肝是肿瘤远处转移的主要部位，然而，我们对PDAC患者肝转移的治疗方法仍然明显缺乏。因此，迫切需要阐明驱动PDAC肝转移的分子机制，这可能为开发更有效的治疗方法铺平道路，并最终提高晚期患者的生存率。
作者全面分析了PDAC原发肿瘤和配对的肝转移瘤的肿瘤免疫微环境TME景观。不仅揭示了肿瘤细胞在原发和转移部位之间不同的转录组特性，而且还鉴定了基质和免疫细胞的特定亚型可能有助于转移性病变中免疫抑制微环境形成。这些结果为了解PDAC肝转移和为PDAC转移患者开发转移性个体化治疗提供了有用的机制信息。
Result1 PDAC原发肿瘤和肝转移性病变的单细胞转录组图谱和细胞分型
为了全面了解TME在PDAC转移中的作用，作者对4例PDAC患者（P1-P4）采集的8个新鲜组织进行了单细胞RNA测序，包括三个手术切除的原发性胰腺肿瘤(PT)及其相应的配对肝转移瘤(HM)，以及来自三个患者之一的1个正常胰腺组织(NT -PT-HM和2个PT-HM对，共7个样本)。第4例患者通过超声内镜引导下的细针穿刺(EUS-FNA)获得的肝转移活检。鉴定为12种主要细胞类型，且在正常和癌变胰腺组织中发现了两种独特的细胞类型，即腺泡细胞和内分泌细胞(统称为分泌细胞)，而在肝转移组织中却没有发现，证明数据分析的细胞类型注释无偏好性[图1]。
作者注意到导管细胞和成纤维细胞的比例在每个患者中都有很大的不同，这与之前在其他癌症类型中的发现一致。有趣的是，三种细胞类型：导管细胞、成纤维细胞和髓系细胞在患者或组织类型中表现出高度异质性，同时也是差异表达基因(DEGs)最多的细胞类型，表明这些细胞类型在不同环境中具有高度动态的转录状态。此外，作者使用CIBERSORTx的反卷积分析，在更大队列配对的原发性和转移性PDAC样本的大量RNA-seq数据中验证了上述发现。作者观察到样本中基质细胞和髓系细胞的相对丰度与发表的RNA-seq数据的相似。
图1 原发性和配对转移PDAC组织的单细胞转录组学分析
Result2 导管细胞表现出高度异质性的CNV模式
作者根据每个亚群高表达的基因将导管细胞进一步分成6个亚群， MKI67+细胞几乎只出现在肿瘤组织中，提示肿瘤细胞具有高增值的能力。相反，RPS3+细胞是出现在NT组织的主要导管细胞群，表示这些细胞是恶性程度低的（称为“良性导管细胞”）。
为了进一步确定导管细胞亚群的恶性程度，inferCNV分析显示，在NT样本中几乎没有观察到CNV事件。与NT和PT组织相比，来源于HM组织的胆管细胞展现出显著的高CNV水平，预示着高恶性表型。此外，基因集变异分析(GSVA)发现，CNV高水平组主要富集于TGF-β信号通路、NOTCH信号通路、MYC靶点和上皮-间质转化通路。
为了探讨在本研究中发现的导管细胞亚型infer的临床意义，作者利用CIBERSORTx估计了来自TCGA PDAC队列患者样本中每个导管细胞亚群的百分比。有趣的是，CEACAM6+细胞和CEACAM5+导管细胞的丰度均与较差的总生存率(OS)显著相关。相反，MALAT1+细胞的丰度与较好的OS相关，这与该细胞高表达基因富集的“白细胞介导免疫” 免疫系统过程的正向调节”和“淋巴细胞活化的正向调节”相关的观察结果一致[图2]。
图2 导管细胞的转录特征和CNV异质性
Result3 从原发性到转移性PDAC，发育轨迹决定了不同的导管细胞状态和进化动力学
如上所述，MKI67+ 导管细胞可能充当一种类型再生/增殖性肿瘤细胞，因为它们只存在于肿瘤而非正常组织中，而 CEACAM5+ 导管细胞可能代表一类具有高水平 CNV 的恶性转移细胞，它们在 HM 组织中占主导地位。作者使用RNA velocity和Monocle2进行了无监督的细胞轨迹分析。两种分析结果均显示导管细胞起源于干细胞样/增殖细胞，基于Monocle2的伪时间轨迹分析定义了5种细胞state(S1-S5)。然而，CEACAM5/6+ 的导管细胞是S5 state主要的cluster，并且仅在肿瘤组织的最后阶段出现，显示出其高度恶性的性质，称为“胰腺导管腺癌细胞”。
由于S5代表与胰腺癌转移相关的终点导管细胞状态，作者将S5中来源于HM组织的导管细胞中高表达的基因，以及CNV水平细胞中高表达的标记基因进行维恩分析，显示了11个共同的差异表达基因。这组基因可能是恶性转移细胞的潜在分子标记。值得注意的是，LITAF和SPRR1B在转移性中高表达和在TCGA数据集中这两个基因的高表达与预后不良显著相关。免疫组化的结果显示，相比于PT组织，LITAF蛋白在HM组织中上调。此外，IHC分析也证实了这一点， 提示到LITAF的表达与PDAC的转移进展有关。
图3 拟时序分析显示不同导管细胞的分化state
Result4 癌症相关成纤维细胞亚型及其对转移性PDAC微环境的贡献
接下来，本研究分析了肿瘤微环境中成纤维细胞。发现所有的成纤维细胞群都高表达癌症相关成纤维细胞(CAFs)标记物。根据已知marker将成纤维分成3类主要的细胞亚群：cluster0-5为肌成纤维细胞(myCAFs)、cluster6为抗原呈递细胞成纤维(apCAFs)、cluster7为炎症相关成纤维(iCAFs)。本研究中apCAF和iCAFs大部份富集于NT组织。myCAF cluster中，（RGS5+ myCAF）主要存在于HM组织中，所有myCAF cluster中，都高表达与侵袭性胰腺癌相关的FN1，。通过多色免疫荧光染色验证了αSMA和RGS5在PT和HM组织中共表达，且在HM组织中，RGS5+ myCAFs在导管细胞周围的富集明显高于在PT组织中，这凸显了RGS5+ myCAFs在PDAC转移微环境中的潜在生物学意义。
为了探讨这些不同的CAF亚群在胰腺癌转移中的发展机制和潜在作用，拟时序和RNA速率显示CFD+ iCAF是最早和最原始的细胞群，RGS5+ myCAF是最成熟的细胞群。揭示了五种不同的细胞state(S1-S5)和两条主要的轨迹路线，这两个state通过来自PT肿瘤的CAFs向来自HM肿瘤的myCAFs富集的细胞state分化，提示两种分化轨迹都与胰腺癌转移有关。综上所述，该研究揭示了PDAC 转移进展过程中特定 myCAF 亚群的富集。
图4 原发和转移性PDAC组织肿瘤微环境中成纤维细胞的转录谱分析
Result5 脂质相关巨噬细胞(LAMs)在PDAC肝转移中扮演重要的角色
因为HM组织中巨噬细胞/单核细胞的比例明显高于PT组织，作者研究了PDAC肝转移中髓系来源细胞的组成和基因表达。脂肪相关巨噬细胞LAM1和LAM2亚群都高表达与促进癌症进展的TAMs分泌的SPP1基因；然后LAM3和LAM4高表达免疫抑制和肿瘤促进相关的CCL18，其中，LAM3细胞主要存在于HM组织中。在HM组织中LAM3细胞表达的脂质代谢相关基因和免疫相关基因都高于PT和NT组织，LAM3细胞高表达免疫抑制分子，且与不良预后显著相关。这些数据表明CCL18+ LAM3细胞在PDAC转移微环境中具有重要作用。
为了解LAMs在PDAC转移中的代谢谱，利用scMetabolism分析发现HM组织中的LAM代谢评分明显高于PT和NT组织。特别是在HM组织中富集的LAM3细胞在所有LAM中表现出最高的代谢活性，这表明它们在转移部位非常重要和充满活力的。
据报道，中性粒细胞是转移性肿瘤微环境的重要组成部分，且在HM组织中显著富集。作者鉴定了两个中性粒细胞群体。其中，与PT和NT组织相比，S100A8+中性粒细胞标记物在HM组织中的表达显著升高，而S100A8几乎只在HM组织中表达。通过免疫荧光染色进一步证实了HM组织中S100A8+中性粒细胞的浸润增加，表明S100A8+中性粒细胞的浸润与PDAC的转移进展密切相关。
图5 髓系细胞在原发肿瘤和肝转移组织肿瘤微环境中的转录图谱
Result6 淋巴细胞重编程在PDAC中的转移性微环境
接下来，作者将淋巴细胞分成7类CD4T，4类CD8+ T和1类NK细胞。值得注意的是，NK细胞中GNLY、NKG7、CCL3和KLRD1在肿瘤组织中高表达，特别是在HM组织中。此外，NK细胞的细胞毒性基因表达显著上调。免疫荧光染色也显示，HM组织中GNLY+ NK细胞较PT组织增加，提示NK细胞在PDAC的转移性生长中起着重要作用。类似的，FOXP3+ Treg细胞在PT和HM肿瘤组织中大量富集，且免疫检查点基因在HM中显著高表达，表明FOXP3+ Treg细胞可能在转移性PDAC中发挥作用。CXCL13+ TFH细胞在GZMA、GZMB、TNFSF10、GNLY等细胞毒性基因高表达的肿瘤中也有富集。而HM组织中TFH细胞的比例则低于PT组织。值得注意的是，CXCL13+ TFH细胞高表达可增强T细胞毒性的免疫检查点相关蛋白PDCD1、LAG3和HAVCR2。总之，这些数据表明，多个免疫检查点基因在Treg和TFH细胞群体中表达。特别是，一些检查点基因在转移微环境中（HM组织）的Treg细胞中显著上调。
图6 原发肿瘤和肝转移组织的肿瘤微环境中淋巴样细胞的转录景观
Result7 淋巴细胞重编程在PDAC中的转移性微环境
最后，为了解读PDAC转移过程中肿瘤细胞和肿瘤微环境中其他细胞之间的互做，CellPhoneDB显示，不同细胞类型在HM组织中的相互作用远低于PT组织。且HM组织中免疫细胞（特别是NK/T细胞）与其他类型的细胞之间的相互作用显著减少。作者还发现在HM组织中，NK/T细胞几乎没有与肿瘤导管细胞发生相互作用；与PT组织相比，HM组织中髓系细胞与导管细胞之间的相互作用也显著减少，提示转移性肿瘤细胞与周边环境接触的较少，这可能是PDAC细胞在转移部位定植的重要机制。
图7 原发性和转移性PDAC组织肿瘤微环境中细胞-细胞相互作用网络的动态
本研究为配对原发和转移PDAC肿瘤组织的肿瘤微环境中细胞组分的转录谱和功能特征提供了深入的见解。
参考文献
Zhang S, Fang W, Zhou S et al. Single cell transcriptomic analyses implicate an immunosuppressive tumor microenvironment in pancreatic cancer liver metastasis. Nat Commun. 2023 Aug 23;14(1):5123. doi: 10.1038/s41467-023-40727-7.
