为了理解发育和疾病发生机制，研究人员需要揭示复杂的多细胞组织的结构。组织学和免疫荧光技术可显示组织形态学和生物标志物。空间 RNA 测序(RNA-seq)利用新一代测序(NGS) 的力量，以空间分辨率分析基因表达1。
空间转录组学实验将分子和形态学特征相结合，可以提供以前无法获得的组织生物学信息。组织范围内的全转录组分析可以实现真正的探索性科学研究，并有助于揭示健康和疾病状态下细胞之间的空间关系2-7。
今天，为大家介绍的是一种从组织切片绘制完整转录组，同时保留形态学背景的方案：
使用10x Genomics的Visium空间基因表达，对整个组织切片进行转录分析。
使用NovaSeq™6000、NextSeq™ 2000、NextSeq™ 1000 或 NextSeq™ 550系统对空间RNA-Seq文库进行测序。
可视化覆盖基因活性的组织形态，以了解正常组织和病变组织细胞之间的空间关系。
实验方案概述
典型的空间RNA-Seq实验遵循一个由组织样本制备、成像、 文库制备、测序和分析组成的工作流程（图1）。本实验方案使用10x Genomics的Visium空间基因表达和成熟的Illumina测序技术。从新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织开始，制成切片并置于Visium玻片上。对组织切片进行染色，使用 Visium试剂生成添加条形码、空间感知的全转录组文库。在Illumina生产规模的测序系统上对文库进行测序， 如 NovaSeq™ 6000、NextSeq™ 2000、NextSeq™ 100或NextSeq™ 550系统。使用 Space Ranger 流程(10x Genomics)进行数据分析，借助来自 Visium 玻片的空间条形码，将转录组基因表达结果与组织位置相关联。Loupe Browser软件(10x Genomics) 可以轻松地在组织图像的形态学数据之上可视化和探索空间基因表达数据。
图1：空间 RNA-Seq 实验的工作流程
1）制备组织切片
根据您的样本类型(新鲜冷冻或 FFPE)选择合适的 Visium 空间基因表达实验方案。可在10x Genomics 支持中心网站上获得Visium 样本制备的演示方案8-9。
2）对组织切片进行染色和成像
使用标准技术对放置在 Visium 玻片上的组织切片进行苏木精-伊红(H&E)或免疫荧光染色。使用显微镜对染色组织切片进行成像。成功的基因表达可视化高度依赖于良好的染色和成像实践10。
3）透化组织并构建文库
对组织切片成像后，可使用Visium空间基因表达试剂盒捕获新鲜冷冻或 FFPE组织的转录本。Visium 空间基因表达玻片有四个正方形区域或捕获区域，每个玻片最多可运行四个组织切片*。每个捕获区域有数千个条形码位点，包含数百万个捕获寡核苷酸，每个位点都有唯一的空间条形码(图2)。
* 在文库制备期间，每个捕获区域还会获得一个样本条形码，以便在一次测序运行中，可以混合来自不同捕获区域的多个文库。其他Visium玻片的每张玻片有两个或八个捕获区域。
图2：Visium 空间基因表达玻片设计
4）使用Illumina仪器测序
依照空间组学的测序需求，建议在 NovaSeq™ 6000、NextSeq™ 2000、NextSeq™ 1000或NextSeq™ 550系统上对Visium空间基因表达文库进行测序(表1)。小规模仪器，如iSeq™ 100系统可用于文库质量控制11。
表1：Illumina 测序系统上 Visium 空间基因表达分析的样本通量示例
Visium空间基因表达文库包含标准的Illumina双端构建体， 两侧为i5和i7标签，这些标签是Illumina 流动槽结合所必需的(表2，图3)。Read 1引物用于测序16 bp的空间条形码和长达12 bp的唯一分子标记(UMI)。Read 2引物用于测序cDNA，或连接探针、插入片段。两个10 bp样本标签在i5和i7 read中进行测序12。
Visium文库的建议测序深度取决于几个因素，包括组织复杂性、组织覆盖度和实验目的。空间基因表达文库需要通过双端测序运行进行测序。（更多详细信息，请下载全文）
表2：Visium空间基因表达文库的建议read 配置
图3：Visium 空间基因表达文库配置— Visium空间基因表达文库包括与 Illumina 测序系统兼容的标准双端构建体。
5）数据的分析和可视化
在 Visium工作流程中，捕获两种主要数据类型:组织图像和BCL或FASTQ格式的测序数据。Space Ranger分析流程使用这两种数据输入将Visium测序数据与图像比对。根据相关的空间条形码，将捕获的检测到的每个基因转录本分配至组织图像上的空间位置。数据处理后，您可以使用Loupe Browser可视化软件轻松查询空间基因表达数据的不同视图。Loupe Browser允许您研究重要的基因、表征和分析簇，并进行差异表达分析。或者，您可以使用第三方工具进一步处理数据。
数据亮点
空间转录组学分析能够在新鲜冷冻组织(图4)13或 FFPE样本 (图5)的组织环境中对基因表达进行高分辨率表征14。
图4:新鲜冷冻小鼠大脑数据亮点—(A)小鼠大脑冠状切片的 H&E 染色图像。(B)覆盖全部UMI的Visium 数据，用于基于总差异表达基因的全转录 组分析或空间天然位点聚类分析。(C)簇 4 中表达水平最高的基因列表13。
图 5:乳腺导管原位癌的 FFPE 乳腺组织数据亮点 — 使用适用 FFPE 的 Visium 空间基因表达，对乳腺导管原位癌 FFPE 样本中约 1.8 万个基因进行了检测。(A)H&E 染色图像与 Visium 的数据叠加，用于 FFPE 全转录组分析，此处显示为(B)基因总数和(C)位点聚类分析。(D)关键乳腺癌基因的表达水 平和空间结构如下所示:ERBB2(HER2)、孕酮受体(PGR) 和雌激素受体(ESR1)14。
专家支持
10x Genomics 和 Illumina 团队合作，确保您在对 Visium 空间基因表达文库进行测序时，在整个工作流程中得到充分支持。如有检测和分析相关问题，请联系10x Genomics 支持中心 (support@10xgenomics.com)，如有测序相关问题，请联系 Illumina 支持中心 (techsupport@illumina.com)。这些团队还可以合作处理更复杂的问题。
NovaSeq™ 6000系统
NextSeq™ 1000和NextSeq™ 2000系统
NextSeq™ 550系统
Visium空间基因表达
参考文献
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