前言
代谢物是生化调控的最终产物，可以实时准确地表征细胞的生化表型。由于细胞的异质性和某些代谢物的快速周转，传统的检测大量细胞的方法无法准确反映单个细胞的情况，因此对单个细胞内代谢物的检测越来越有必要。
单细胞代谢组学可以直接获得单个细胞的代谢物信息，从而深入了解单个细胞的生理行为与其化学成分之间的关系。对于分子生物学研究和实际临床应用来说，需要在短时间内对大量的单个细胞进行分析。因此，迫切需要高通量单细胞分析方法。
2022年6月,由中国科学院大连化物所许国旺研究团队在Analytica chimica acta期刊(IF:6.911)发表的题为“High-throughput single cell metabolomics and cellular heterogeneity exploration by inertial microfluidics coupled with pulsed electric field-induced electrospray ionization-high resolution mass spectrometry”的研究成果，运用单细胞代谢组学开发了一种新型的非对称蛇形通道微流控芯片，一次性能分析3000多个单细胞；可运用于哺乳动物肿瘤细胞酵母细胞分析。
研究背景
为了实现高通量分析，需要进行细胞分离和聚焦，以确保单个细胞逐个引入质谱仪。目前还没有一种方法可以在一次实验中分析数千个细胞，而分析大量的细胞对于获得有生物学意义的数据是非常重要的。
因此，作者开发了一种新型的非对称蛇形通道微流控芯片，结合脉冲电场诱导电喷雾电离-高分辨质谱(PEF-ESI-HRMS芯片)方法，用于近生理条件下的高通量单细胞分析，一次实验可分析3000多个单细胞。在肿瘤细胞中，大约有120种代谢物被注释，并且根据单个细胞代谢谱成功区分了两种不同的肿瘤细胞(MCF7和HepG2细胞)。
技术流程
研究结果
1.非对称蛇形微流控芯片的设计
为了实现高通量分析，在MS分析之前加入细胞分离和聚焦系统是必不可少的。微流体中的惯性聚焦可以在不使用鞘液或其他外场的情况下实现细胞的精确横向平衡位置控制和细胞间距的调节。使用这种无鞘细胞聚焦方法，细胞中的代谢物不会被过度稀释，从而可以扩大代谢物的检测范围，是一种很有前途的单细胞大规模细胞仪的进样方法。
作者设计了一种具有不对称蛇形通道的微流控芯片，它由15个重复的S形单元和一个相连的直通道组成(图1a）入口区域的微通道被加宽，以减少细胞表面的法向应力和剪切应力。模拟测试结果表明，微流控芯片对哺乳动物癌细胞具有分散和聚焦作用。
图1 | 非对称蛇形微流控芯片的设计
a.蛇形水道的几何示意图
b.第8个大弯道和第9个小弯道断面二次流分布及矢量
c.4 s后相同直径细胞的流线
2.PEF-ESI-HRMS芯片的配置和性能
PEF-ESI-HRMS芯片包含四个部分：用于输送细胞悬浮液的注射泵、用于分散和聚焦细胞的不对称蛇形通道微流体芯片、PEF-ESI源和Q Exactive HF质谱仪。为了保持细胞活力和完整性，将细胞悬浮在碳酸氢铵等渗溶液中。通过注射泵将细胞悬浮液注入微流控芯片，然后通过不对称微通道分散和聚焦细胞。当有序的单细胞到达纳米喷雾发射器的尖端，电源产生的高压方波脉冲将细胞分裂。最后细胞内容物被立即释放并被离子化，然后通过质谱仪进行分析，从而获得单个活细胞中代谢物的信息。
为了评估PEF-ESI-HRMS芯片的性能，将两种癌细胞系（MCF7和HepG2）的细胞悬液引入系统。如总离子色谱图（TIC）所示（图2a），当细胞悬浮液流动时，获得了单个细胞的脉冲样信号。m/z 184.0733 处的峰是磷酸胆碱，这是一种主要存在于细胞质中的重要代谢物，该信号的出现代表细胞的破坏，因此被用作单细胞质谱的标记。磷酸胆碱的EIC（图2b）与TIC具有良好的一致性，表明脉冲电场诱导的ESI源具有实现细胞碎裂和代谢物电离的能力。从MCF7（图2c）和HepG2（图2d）两种不同的单细胞代谢谱中，可以观察到HepG2肝癌细胞中代谢物的总体相对丰度较高。
图2 | 采用PEF-ESI-HRMS分析MCF7和HepG2细胞系组成的不同细胞悬液
需要注意的是，高浓度细胞悬浮液中粒子间相互作用会限制聚焦程度。细胞悬液的流速和浓度是影响单细胞质谱的两个重要因素。作者研究了不同的流速以优化分析通量并提高系统稳定性。综合考虑微流控芯片接口所能承受的压力和最大分析通量后，选择1μL min为合适流速。为了适配这种相对较高的注入流速，在纳米电喷雾发射器中施加幅度为5 kV Vpp和频率为200 Hz的方波电压。另外，以1μL min 优化细胞悬浮液的浓度，结果如图3b所示。单位时间内单细胞MS信号的数量随着细胞浓度的增加而增加，并且它们之间存在线性相关性。如图3c所示，以1μL min 的流速和浓度为8 × 10个细胞 mL 的MCF7细胞悬浮液，最大通量可达到约80个细胞每分钟。与之前报道的方法相比，该方法得到的数据更加稳定。
图3 | HepG2和MCF7细胞悬液流速和细胞浓度对单细胞MS分析的影响
提取每个脉冲峰最高点的质谱信息，用于进一步的数据处理和分析。使用基于PEF-ESI-HRMS芯片的技术，可以从单个细胞中检测到900多个特征峰，从群体细胞的LC-MS分析结果获得的精确质量和二级质谱，可以鉴定出120种代谢物。对这些代谢物按照其化学特性进行分类，包括大多数重要的功能性代谢物，如氨基酸、酰基肉碱、羧酸及其衍生物或类似物（图3d）。
为了尽可能地保持细胞处于天然状态，使用等渗盐溶液作为萃取溶剂，所以检测到的代谢物主要是水溶性好的极性代谢物。总的来说，基于PEF-ESI-HRMS芯片的质谱流式细胞仪不仅展示出高通量，而且对极性代谢物检测的覆盖率也很高。此外，测试了仪器系统的稳定性，连续运行约3小时，仍然可以获得稳定的质谱信号，而不会堵塞微通道或纳米喷雾发射器。
3. PEF-ESI-HRMS芯片在单个哺乳动物细胞高通量分析中的实际应用
使用超过3000个HepG2细胞和MCF7细胞进行单细胞代谢检测分析，并使用每种类型的1000个细胞的质谱数据进行进一步分析，来证明这种高通量方法区分各种癌细胞的实用性。根据 PCA 图可以很好地区分这两种类型的细胞（图4a）。
基于机器学习的t-SNE和UMAP算法被用于挖掘和可视化复杂的单细胞质谱数据。可以清楚地观察到MCF7和HepG2细胞的分离，并揭示了两种癌细胞显著的代谢异质性。云雨图为了识别区分这两种癌细胞的潜在生物标志物并评估它们的性能，进行了ROC分析。结果表明这些代谢物可以作为区分 MCF7和HepG2细胞的生物标志物。然后作者使用无监督学习算法孤立森林来检测同种细胞中的异常值，结果在1000个HepG2细胞中发现了32个潜在异常值（图4c）。非异常值的HepG2细胞在PCA图中得到了很好的聚类，进一步证明了该技术在分析大规模单细胞样品时良好的稳定性。总体而言，HepG2细胞异常细胞中的代谢物含量高于非异常细胞（图4d）。同样地，鉴定了1000个MCF7细胞中的61个潜在异常值，结果如图4e所示。与能量代谢密切相关的几种关键代谢物在异常MCF7 细胞中的含量相对较高（图4f）。基于以上结果，异质性细胞的概率约为5%，表明该技术具有探索细胞代谢异质性的潜力。
图4 | PEF-ESI-HRMS芯片在单个哺乳动物细胞高通量分析
a.基于单个HepG2和MCF7细胞的前两个主成分的PCA图
b.MCF7和HepG2单细胞中亮氨酸和肌酸相对含量的云雨图云雨图
c.HepG2细胞中的异常值
d.HepG2细胞的异常值和非异常值中γ -氨基丁酸和氨基丙酮相对含量的云雨图
e.MCF7细胞的异常值
f.MCF7细胞异常值和非异常值缬氨酸和磷酸相对含量的修正云雨图
4. 在单个酵母细胞代谢谱分析中的实际应用
为了证明该技术对有细胞壁的细胞也具有破坏能力，使用酿酒酵母作为模型细胞进行实验。这类酵母细胞的细胞壁具有弹性结构，常规代谢组学会使用酶解法、研磨法和超声波法破坏酵母细胞壁，但这些方法都不适合单酵母分析。有研究表明，脉冲电场可以破坏酵母细胞壁，因此作者使用方波高压脉冲使细胞快速被电传孔，释放出代谢物并被电离。从单个酵母细胞中获得的鸟氨酸、肌氨酸和赖氨酸的TIC和EICs（图5a和5b）。在正离子模式下从单个酵母细胞中检测到40多种代谢物，说明了该方法在具有细胞壁的单细胞代谢组学中的潜在应用。
图5 | 单个酵母细胞代谢谱分析
a.分析单个酵母细胞的装置示意图
b.单个酵母细胞中获得鸟氨酸、肌氨酸和赖氨酸的TIC和EICs图
研究讨论
总之，作者建立了一种通用的基于PEF-ESI-HRMS芯片的方法，用于在接近生理条件下进行高通量单细胞代谢组学分析。PEF-ESI-HRMS芯片与惯性微流体装置的新型组合在提供更高的分析通量和稳定的电喷雾方面具有显著优势，并保持高分析灵敏度。1分钟内可完成80个癌细胞的分析，从单个HepG2或MCF7细胞中提取900多个特征峰，初步鉴定出120个代谢物，通过这种高通量方法实现了对这两种癌细胞系的区分。
此外，通过孤立森林算法进一步识别了同类细胞内的代谢异常值，说明该方法具有鉴别代谢异质性细胞的潜力。该方法具有良好的分析稳定性，可以在一次实验中连续分析3000多个细胞。除此之外，PEF-ESI电离源还具有破碎有细胞壁的细胞如酵母的能力，并进行分析。因此，该技术有望为新一代高通量质谱流式细胞仪提供灵感，并为大规模单细胞代谢组学分析发挥加速作用，以帮助生物科学和临床研究。
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