前言
药物性肝损伤(DILI)是药物安全使用的主要问题之一。在传统医学中用于治疗炎症、细菌感染和过敏的Cortex Dictamni（CD）对肝脏有毒性作用。根据之前报道，以Fraxinellone（FRA）为代表的几种呋喃环化合物是从CD中提取的主要活性成分，会导致肝毒性。肝脏作为氨基酸代谢的重要器官，在氨基酸代谢平衡中起重要作用。当肝细胞受到严重损伤时，会导致氨基酸代谢紊乱。因此，氨基酸可能是很好的DILI生物标志物。
2022年4月，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所靳洪涛教授课题组在molecules发表的题为“Fraxinellone Induces Hepatotoxicity in Zebrafish through Oxidative Stress and the Transporters Pathway”（IF:4.411）的研究成果，通过氨基酸靶向代谢组学研究方法，发现了斑马鱼肝损伤的氨基酸水平变化特征，探究了Fraxinellone致斑马鱼肝毒性的机制，为防治药物性肝损伤提供了理论依据。
中文标题：Fraxinellone 通过氧化应激和转运途径诱导斑马鱼的肝毒性
研究对象：斑马鱼
发表期刊：molecules
影响因子：4.411
发表时间：2022年4月
合作单位：中国医学科学院北京协和医学院药物研究所
运用生物技术：氨基酸靶向代谢组学
研究背景
氨基酸代谢组学可用于了解在氨基酸水平上DILI是否可与健康对照区分，组间代谢特征和代谢产物氨基酸的差异也可以解释中草药致DILI的不同机制。目前对FRA肝毒性机制的研究大多仅限于体内药代动力学检测和肝微粒体系统代谢组的结构鉴定。因此，本研究选择了模式生物斑马鱼，目的是在研究代谢激活的分子机制的基础上，寻找体内可能的毒性途径和代谢标志物，为临床预防和治疗药物性肝损伤奠定基础。
研究思路
研究结果
1、Fraxinellone对斑马鱼幼虫的肝毒性作用
以30μM（LD 10）的亚致死剂量为上限，在超景深显微镜下发现正常斑马鱼幼虫的肝脏在显微镜下比较透明，但用肝毒性药物处理后，肝脏组织质地无定形，结构紊乱，颜色变黑，表示肝脏退化。用10、20或30 μM FRA处理48 h后，斑马鱼肝脏区域变黑，灰度值随着FRA浓度的增加而降低（图1A）。
荧光显微镜下，AO染色显示，斑马鱼幼虫暴露于FRA后荧光强度增加，凋亡细胞比例高于空白对照组（图2C）。斑马鱼匀浆上清液中的 ALT、AST、TBIL 和 DBIL 水平以浓度依赖性方式显著增加（图2 D-G）。这些结果表明FRA对斑马鱼幼虫有很强的肝毒性。
图1 | FRA 对斑马鱼幼虫的肝毒性作用
2、FRA 诱导的肝毒性的组织病理学评估
通过用苏木精和伊红 (H&E) 染色进行 FRA 诱导的肝毒性的组织病理学评估（图 2）。低倍率成像证实肝脏位于斑马鱼的腹腔内，周围的肠和胰腺也可见。高倍镜下，空白对照组斑马鱼肝细胞完整，排列紧密规则，细胞核呈圆形，位于细胞中心。FRA给药组斑马鱼肝细胞肿胀，由于脂肪变性，细胞核向细胞一侧拥挤，肝细胞细胞质空泡化，点状或局灶性坏死，呈现肝损伤的典型表现。
图2 | FRA 对肝脏形态的影响
3、FRA对胆汁酸转运蛋白和JNK/p53通路表达的影响
通过 qRT-PCR探究参与维持胆汁酸稳态（P-gp、Bsep 和 Ntcp）和细胞凋亡调节（JNK1、p53 和 caspase-3）基因的表达水平。与对照组相比，FRA高剂量组Bsep、P-gp和Ntcp的mRNA表达水平下降（图3A -C），JNK1、caspas -3e的mRNA表达水平降低，p53的mRNA表达水平增加（图 5D-F)。
蛋白质印迹分析结果表明JNK和p53的磷酸化水平以浓度依赖性方式显著增加。JNK促凋亡途径下游标志物Bax 和cleaved caspase-3的蛋白质水平随着JNK磷酸化水平的增加而增加（图 5 G-K）。与对照组相比，FRA组JNK磷酸化水平升高，促进线粒体中凋亡蛋白Bax的表达，进一步促进细胞凋亡。
图3 | FRA 对胆汁酸转运蛋白和 JNK/p53 通路成分表达水平的影响
4、KCZ 对 FRA 诱导的肝毒性的抑制作用
相同的给药条件下，添加KCZ的浓度越高，FRA 诱导的死亡率显著降低（图 4A）。选择1 μM KCZ作为后续机制验证的安全剂量。联合给药48 h后，KCZ联合处理组ALT、AST水平较FRA处理组明显下降，TBIL、DBIL水平下降，与空白对照组相比无显著性差异（图4 B-E）。
图4 | 成纤维细胞靶向慢病毒Trps1过表达和敲除
5、KCZ 改变了 FRA 抑制的转运蛋白和凋亡蛋白的表达模式
qRT-PCR和蛋白质印迹结果显示，与 FRA 处理组相比，KCZ 恢复了FRA 抑制的Bsep、P-gp和Ntcp的 mRNA 表达水平，并显著降低了 cyp3a65 mRNA 水平（图 5 A-D）。表明KCZ 可以通过抑制 CYP3A 亚家族成员的表达来减少 FRA 有毒代谢物产生。与 FRA 治疗组相比，p53和caspase-3的 mRNA 表达在KCZ联合处理组显著下降，cleaved caspase-3蛋白表达下降，与空白对照组无显著差异，证实CYP3A抑制剂KCZ改善了FRA的毒性（图5 E-G）。
图5 | KCZ 改变了 FRA 抑制的转运蛋白和凋亡蛋白的表达模式
6、KCZ 恢复被 FRA 改变的氨基酸代谢
为进一步验证FRA的肝脏毒性和KCZ的毒性抑制作用，采用靶向代谢组学方法检测斑马鱼体内氨基酸的动态变化。PCA结果表明，在95%的可信区间内，KCZ处理组和空白对照组重叠最多，而FRA处理组和空白对照组有显著差异。
与FRA处理组相比，KCZ和FRA联合处理组的氨基酸代谢产物呈回调趋势，并与空白对照组部分重叠(图6A)。热图显示，FRA处理后斑马鱼体内半胱氨酸、谷氨酸、亮氨酸和色氨酸的含量显著降低，而解毒产物谷氨酰胺显著增加。KCZ共同处理后，这些氨基酸的表达水平基本恢复(图6B)。
图6 | KCZ 恢复了 FRA 改变的氨基酸代谢谱
相关讨论
在本研究结果中，氨基酸代谢组学揭示FRA诱导肝损伤后，细胞中异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的含量显著下降，表示支链氨基酸可能是潜在的肝损伤标志物。FRA还可引起其他氨基酸代谢紊乱，如脯氨酸、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸含量下降，表明FRA可以显著地诱导斑马鱼氨基酸代谢的失调，导致氧化应激诱导的肝损伤。揭示内源性代谢产物，如氨基酸水平的变化，可以作为早期监测肝脏毒性的潜在标志物。ketoconazole (KCZ)共处理后，氨基酸的表达水平恢复，可以为预防和治疗药物性肝损伤提供新的方法。
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为探究药物性肝损伤的毒性途径和代谢标志物，本文从肝细胞受到损伤，氨基酸代谢会发生紊乱角度出发，综合氨基酸代谢组学结果，探讨斑马鱼肝毒性机制，为防治药物性肝损伤提供理论参考。
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