前言
前列腺炎是一种泌尿生殖系统疾病(CP/CPPS)，是最常见的前列腺炎类型，约占前列腺炎人群的90%-95%。CP/CPPS以盆腔长期慢性疼痛伴或不伴低尿路症状为特征，已成为全球公认的男性健康威胁。近年来越来越多的证据表明免疫失衡在发病机制中发挥了重要作用。因此，CP/CPPS也被认为是一种器官特异性的自身免疫性疾病。T淋巴细胞，特别是CD4+T细胞，被发现是CP/CPPS发病机制的主要贡献者，Th17细胞是CD4+T细胞的一个子集，据报道，Th17细胞与多种自身免疫性疾病的发生密切相关。
2022年7月，安徽医科大学第一附属医院泌尿外科梁朝朝教授课题组在《Frontiers in Immunology》（IF：8.796）期刊发表了题为“Gut Microflora Modulates Th17/Treg Cell Differentiation in Experimental Autoimmune Prostatitis via the Short-Chain Fatty Acid Propionate”的研究成果，本研究运用粪便16s rRNA测序和非靶向/靶向代谢组学等研究方法分析了EAP小鼠肠道微生物组和代谢产物，以研究EAP中肠道微生物群和相关代谢物的丰度是否发生改变，从而发现肠道菌群通过其代谢物对EAP小鼠模型中免疫反应调节的影响。
杜和喜、岳少宇、牛迪为第一作者，梁朝朝、张力、陈先国、李春为共同通讯作者，欧易/鹿明生物提供该项目粪便16s rRNA测序和非靶向/靶向代谢组学相关工作。
研究背景
肠道菌群系在调节宿主的免疫/炎症反应中发挥着不可或缺的作用。一般来说，肠道菌群的系统功能主要归因于微生物代谢组，特别是短链脂肪酸(SCFAs)，这是膳食纤维发酵最具特征的最终产物。一方面，这些细菌来源的SCFAs可以进入循环，调节肠外器官中的免疫系统，包括Th17和Treg细胞。另一方面，SCFAs已被证明可以促进肠道中的免疫细胞进入循环和远端组织。因此，SCFA代谢与免疫紊乱之间的关系已被证实和接受。目前尚不清楚肠道微生物驱动的SCFAs是否对前列腺炎有影响。
研究思路
实验方法
研究材料：小鼠
研究流程：
1.EAP的小鼠模型建立
2.组织病理学和免疫组化
3.流式细胞仪
4.CD4+T细胞的分离和体外分化
5.慢病毒感染
6.酶联免疫吸附测定
7.DNA提取和16s rRNA测序
8.粪便非靶向/靶向代谢组学
9.SCFAs测量分析
10.丙酸SCFA治疗分析
11.蛋白印迹分析
12.实时聚合酶链式反应
13.粪便微生物群移植
研究结果
1.Th17和Treg细胞比例及EAP相对细胞因子水平显著异常
在本研究中，作者首先通过两次皮下免疫建立了EAP小鼠模型(图1A)。EAP模型通过组织学检查和盆腔疼痛测量结果进行评估。如图1B-D所示，与对照组相比，EAP组的前列腺炎症和对触觉异常痛的反应频率均明显增加，说明小鼠EAP模型建立成功。接下来，作者分析了对照组和EAP小鼠脾脏淋巴细胞中Th17和Treg细胞的百分比。最后，作者对两组前列腺切片进行IL-17A和FoxP3进行免疫组化染色。结果显示，EAP小鼠前列腺组织中il-17a阳性染色细胞比例增加，foxp3阳性染色细胞比例降低(图1M、N)。
图1 | 评价EAP模型、Th17/Treg细胞比例及相关炎症细胞因子水平
2.EAP中粪便代谢组的改变
肠道菌群在免疫稳态中起着关键作用，通常通过其代谢物调节宿主的免疫系统。因此，作者运用代谢组学分析来研究EAP小鼠的肠道代谢谱。通过对粪便进行GC-MS非靶向代谢组学分析 ，发现对照组和EAP小鼠之间共有94种代谢物的丰度差异(图2A，B)。我们进一步对对照组和EAP组之间的差异表达通路进行了KEGG通路富集分析(图2C)。
图2 | 对照组和EAP小鼠的代谢组学谱
3.EAP的肠道菌群与对照组有显著差异
EAP小鼠的脂肪多样性指数、香农指数、辛普森指数、观察物种指数和PD_whole_tree均显著低于对照组，表明肠道微生物群的a-多样性发生了显著改变(图3A）。PCoA分析是生物多样性的一个指标，结果显示对照组和EAP小鼠样本之间存在明显的分离，表明两组之间的微生物群组成存在显著差异(图3B)。在门水平上，EAP小鼠的厚壁菌门的相对丰度较少，硝化螺旋体、芽胞菌和梭菌门。相反，作者在EAP组中检测到拟杆菌门、蓝藻菌门和白腹杆菌门的增加(图3C）。在属水平上，EAP中乳酸菌明显增加，而其他9个菌群明显减少(图3D）。
图3 | 对照组和EAP小鼠肠道微生物群的比较
4.EAP中丙酸显著降低
通过靶向代谢组学测定六种最丰富的短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和异丁酸）在粪便和血清中的浓度。发现对照组小鼠粪便中丙酸的浓度高于EAP组，其他SCFAs均无差异(图4A）。对EAP小鼠血清中SCFA浓度的分析也显示丙酸含量显著下降(图4B）。
图4 | 对照组和EAP小鼠中SCFAs的绝对浓度
5.补充丙酸可改善EAP，恢复体内Th17/Treg失衡
根据饮用水中是否加入丙酸，将EAP小鼠分为未处理组(EAP组)和丙酸处理组(EAP+PA组)(图5A)。值得注意的是，补充外源性丙酸显著降低了EAP小鼠的前列腺炎症和盆腔疼痛(图5B-D)。此外，丙酸处理抑制了EAP小鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞的分化(图5E-H），但有利于Treg细胞的分化(图5I，J）。此外，口服补充丙酸可降低了EAP小鼠血清中IL-17和GM-CSF的产生，而增加了TGF-b和IL-10的分泌(图5K）。在前列腺组织中观察到与IL-17、TGF-b和IL-10水平相似的结果(图5L）。
图5 | 丙酸可改善EAP，恢复体内Th17/Treg失衡
6.丙酸在体外调控Th17/Treg细胞的分化
作者通过体外实验进一步评估了丙酸对EAP的影响。用丙酸分离出在Th17/Treg分化条件下的CD4+幼稚T细胞(图6A，D)。与预期的一样，丙酸可以抑制更多的CD4+幼稚T细胞分化为Th17细胞(图6B），而它也与促进向Treg细胞的分化有关(图6E）。
图6| 丙酸在体外调控Th17/Treg细胞的分化
7.丙酸通过调节GPR43-HDAC6轴来调节Th17/Treg细胞的分化
为了探讨丙酸是否以GPR依赖的方式调控Th17和Treg细胞的分化，作者检测了GPR43的表达，这是在免疫和代谢中发挥重要作用的GPRs之一，以及细胞内信号传导HDAC6（31）。首先，在Th17和Treg细胞条件下，丙酸刺激下GPR43的表达增加，而使用LV-shGPR43则抑制了GPR43的表达(图7A)。作者还观察到，当分离的CD4+T细胞用丙酸处理，并在Th17/Treg分化条件下孵育时，HDAC6的表达水平降低。然而，在LV-shGPR43感染后，它显著增加(图7B）。另外，抑制GPR43有助于Th17细胞分化的急剧增加(图7C，D），而Treg细胞的分化明显减少(图7E，F）。前列腺组织的免疫组化检测显示，在LV-shGPR43处理的EAP小鼠中，GPR43阳性细胞减少，HDAC6的表达水平增加(图7G，H)。
图7 | 丙酸通过调节GPR43-HDAC6轴来调节Th17/Treg细胞的分化
8.EAP粪便移植可诱导受体Treg细胞频率的降低
为了进一步确定肠道微生物群的改变是否导致了EAP中Th17/Treg的失衡，作者运用粪便移植实验，将对照组或EAP小鼠的粪便悬液灌胃到抗生素处理的伪无菌受体小鼠中(图8A)。图8B-E中，与对照组小鼠的粪便移植相比，EAP小鼠的粪便移植中Treg细胞的比例明显降低(p0.05)。因此，将肠道微生物从EAP供体口服转移到健康受体中，导致其Treg细胞频率的降低。
图8 | EAP小鼠粪便移植诱导受体小鼠Treg细胞频率降低
研究讨论
1.EAP中Th17/Treg处于不平衡状态。
2.对照组和EAP小鼠的肠道微生物衍生代谢物存在显著差异，为研究微生物衍生代谢物中脂肪酸在EAP中的作用提供了线索。
3.在EAP中，微生物源性的丙酸显著降低。
4.丙酸有助于改善前列腺炎症，恢复EAP诱导的Th17/Treg失衡。
5.丙酸有助于在体外调节Th17/Treg平衡，进一步加强丙酸在EAP中的免疫调节作用
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本研究为了揭示肠道菌群是否影响CP/CPPS，及其背后的潜在机制，通过皮下免疫建立了一个实验性自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠模型，运用粪便16srRNA测序和非靶向/靶向代谢组学，探索肠道菌群在免疫稳态和自身免疫性疾病的发展中的作用机制，为在饮食干预中补充微生物终产物来改善CP/CPPS患者的免疫障碍提供了一个新的视角。
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