来 源：于 淼，代 悦，刘涛涛，肖永庆，李 丽．基于物质基础与颜色变化相关性分析的制何首乌古今炮制方法探讨 [J]. 中草药, 2023, 54(11):3480-3488.
何首乌为蓼科何首乌属植物何首乌 Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，味苦、甘、涩，性微温。生品具有解毒、消痈、截疟、润肠通便等功效，炮制后味转甘厚而性转温，增强了补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效[1]，故临床多以制品应用[2]。
近年来有关何首乌不良反应事件频发[2-4]，其中以肝毒性为主，由此引发了对何首乌临床安全用药的广泛关注。《中国药典》2020年版收载的制何首乌炮制方法中对于炮制终点的规定仍采用性状描述，即“炖至汁液吸尽；或蒸至内外均呈棕褐色”，缺少客观化的评判标准，易造成饮片炮制程度不一，品质参差不齐等问题，可能成为影响临床疗效并引发临床不良反应的重要因素之一[5]。
本课题组对何首乌古今炮制方法进行了梳理，发现九蒸九晒是古代何首乌的经典炮制方法，始载于宋代《太平圣惠方》[6]，并作为主流炮制方法沿用至清代，其中《本草纲目》记载的“用何首乌赤白各一斤，竹刀刮去粗皮，米泔浸一夜，切片，用黑豆三斗，每次用三升三合三勺，以水泡过，砂锅内铺豆一层，首乌一层，重重铺尽，蒸之，豆熟，取出去豆，将何首乌晒干，再以豆蒸，如此九蒸九晒，乃用”[7]，应用较为广泛，后因炮制方法繁琐，无法满足现代化工业生产的需求而逐渐被无需反复蒸晒的现代炮制方法取代。
但古籍记载何首乌炮制时曾有“（何首乌）制非九次，勿寝其毒”之说[8]，提示反复炮制减毒作用更强。同时，现代研究也表明，九蒸九晒法对何首乌减毒效果最好，与药典法炮制的何首乌相比，对肝细胞生长的抑制率更低、损伤更小[9-10]。因此，九蒸九晒炮制方法不仅具有其合理性，也为解决何首乌临床用药安全性问题提供了新的途径。
目前，部分学者对九蒸九晒制首乌饮片进行了相关研究，采用谱学技术对其化学成分进行定性定量分析，并对其进行了肝毒性评价[11-12]，但现有研究中记载的九蒸九晒方法多受现代方法影响，采用液体辅料（黑豆汁）蒸/炖的方式，而非古代文献记载的固体辅料（黑豆）蒸/炖[7]，其炮制方法的复原有一定偏差性。
同时，现有研究多注重于对饮片内在物质的分析，而忽略了传统性状在其工艺制订和质量评价中的作用。颜色作为中药饮片最直观的性状特征，不仅是其质量评价的重要指标之一，也是炮制工艺重点控制的主要参数[13-14]。何首乌饮片经炮制后颜色加深，主观描述难以准确反映其颜色变化，电子眼作为一种基于模拟人体感官而出现的人工智能感官技术，可以客观表征饮片颜色，尤其能准确区分不同炮制方法饮片间的微小色差，兼具图像采集、数字图像处理和结果反馈功能[15]，目前已广泛应用于中药饮片的颜色测定与质量评价[16-18]。
为了追本溯源，本实验将遵循古代文献记载方法制备九蒸九晒制何首乌饮片，与《中国药典》2020年版收载的炮制方法进行比较，通过主要化学成分的定量分析、基于智能感官分析技术的颜色客观表征，以及二者的相关性分析，探讨制何首乌古今炮制方法的差异性。为进一步规范何首乌饮片炮制工艺，稳定制何首乌饮片质量，提高其临床应用安全性奠定基础。
本实验通过对古代经典九蒸九晒炮制法与药典法制何首乌饮片的对比研究，发现二者主要成分含量及颜色的总体变化趋势较为相似，但有程度上的差异，且二者成分组成也有明显的区别。
何首乌中含有鞣质类成分和具有没食子酰基的苷类成分[20-21]，在炮制过程中上述成分受热分解后转化为没食子酸[22-23]，故炮制后没食子酸量显著增加。二苯乙烯和蒽醌类成分是何首乌中的主要有效成分，同时也是其肝毒性的主要物质基础[24-25]，二者的含量及结构与何首乌肝损伤的发生密切相关，可通过控制合理的炮制工艺，将上述2类成分的含量控制在安全有效的范围内，以便提高用药的安全性[26]。二苯乙烯及蒽醌类成分对光、热具有不稳定性[27-28]，在加热炮制过程中会发生分解，在反复蒸、晒过程中会发生光环加成反应[29]，因此，采用连续加热方式的药典法制何首乌比采用间隔蒸、晒方式的九蒸九晒何首乌中上述2类成分含量降低的幅度更为显著。
5-羟甲基糠醛既是Maillard反应产物，又可通过糖的直接降解或脱水产生[30-31]，温度的升高和加热时间的延长均可导致其含量增加[32]，因此5-羟甲基糠醛成为很多采用加热炮制（炒制、蒸制、炖制等）中药饮片的特征性标志物。何首乌中含有的糖类成分以及炮制过程中苷类分解产生的糖类成分均可与氨基成分发生Maillard反应，从而生成5-羟甲基糠醛。
本实验中仅在药典法制何首乌饮片中检测到了5-羟甲基糠醛，而九蒸九晒何首乌饮片中未检出该成分，说明5-羟甲基糠醛的产生与炮制工艺密切相关。药典法采用液体辅料连续炖制，而九蒸九晒法采用固体辅料间隔蒸、晒，何首乌饮片在两种方法炮制过程中的受热程度、加热方式、加热时间及光照等都有着显著差异，且5-羟甲基糠醛性质活泼，对温度、湿度、光、空气较为敏感[33]，可进一步分解为乙酰丙酸和甲酸或是聚合[34]，推测在九蒸九晒何首乌中由于“晒”这一工艺环节，导致已生成的5-羟甲基糠醛分解，因此未能检出。
5-羟甲基糠醛具有抗心肌缺血、抗氧化等作用，同时，该成分还易导致结肠小囊异常生长（aberrant crypt foci，ACF），对人体横纹肌和内脏也具有毒副作用[34]。此外，不同炮制方法对何首乌饮片中主要成分的量比关系也有显著的影响，九蒸九晒制何首乌中各类成分的量比关系约为没食子酸-二苯乙烯苷-蒽醌苷-蒽醌苷元（1∶25∶2∶10），而药典法制何首乌中上述成分的量比关系约为1∶11∶0.3∶7，各成分间量比关系差异显著，因此，古今2种方法制备的何首乌饮片主要药效物质组成及量比关系的显著差异极有可能会成为导致其药效及毒性差异的主要原因，后续将通过相关药效学实验进行系统的研究。
电子眼测定结果表明，不同炮制方法对何首乌饮片颜色的影响也不尽相同。颜色的变化主要源于2个方面，一方面是何首乌在炮制过程中自身化学成分在高温、高湿的条件下发生褐变反应，生成褐色聚合物，导致饮片颜色加深；另一方面是源于炮制过程中辅料的间接影响，药典法应用的液体辅料黑豆汁中含有大量色素类成分[35]，对何首乌饮片起赋色作用，导致其饮片颜色加深，而九蒸九晒方法中应用的是固体辅料黑豆，对何首乌饮片几乎无赋色作用，由此形成了两种方法炮制的何首乌饮片颜色上的差异。
为了进一步分析何首乌饮片物质基础与颜色的相关性，本实验对测定的7种主要化学成分含量与颜色特征值进行了多元统计分析，HCA和PCA结果显示古今方法炮制的何首乌饮片可各自聚为一类，且与生何首乌相比，古、今方法炮制的何首乌饮片可聚为一类，进一步验证了九蒸九晒法与药典法制何首乌饮片的个性特征及共性规律。没食子酸及蒽醌苷元含量与何首乌饮片颜色变深呈正相关，二苯乙烯苷及蒽醌苷含量与何首乌饮片颜色变深呈负相关。因此，可通过快速无损的颜色检测，实现对何首乌饮片炮制工艺的控制及饮片质量的客观评价。
本实验从物质基础与颜色变化的相关性角度对古代经典九蒸九晒炮制方法与现代药典收载的制何首乌炮制方法进行了对比研究，结果显示，2种方法炮制的制何首乌饮片虽然在外观性状的主观评价上具有较高的相似性，但通过现代智能感官分析技术的客观表征和主要药效物质的分析，可以初步证明古今2种方法炮制的制何首乌饮片是2种独立的药效载体，传统经典炮制方法存在的合理性不仅有其悠久临床应用历史的佐证，也有现代科学技术对其科学内涵的阐释，二者不具有替代性。进一步系统开展2种炮制方法的药效学研究，将为全面分析何首乌古今炮制方法，解决何首乌炮制工艺不规范、质量不稳定等问题，提高何首乌临床应用的安全性和有效性提供新的依据。
