2023年4月6日，山东第一医科大学宋国华课题组在Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 杂志（IF=10.514）发表题为“Sleep Deprivation Promotes Endothelial Inflammation and Atherogenesis by Reducing Exosomal miR-182-5p”的研究论文，该研究报道了在睡眠剥夺和动脉粥样硬化的背景下由外泌体介导的小肠上皮-动脉通讯，并通过多组学揭示了 miR-182-5p 在睡眠剥夺后诱导动脉粥样硬化形成和进展中的重要作用，阐明了代谢性心血管疾病发展的潜在机制。
期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology
影响因子：10.514
涉及的服务产品：转录组测序
睡眠不足是现代24小时社会普遍存在的突出问题。有统计表明近一半的成年人每天的睡眠时间少于建议的7至8小时。睡眠不足会增加患糖尿病、癌症、肥胖和心血管疾病 (CVD)的风险。观察性前瞻性队列研究表明，睡眠时间短和睡眠片段化与亚临床多区域动脉粥样硬化风险增加独立相关。动脉粥样硬化被认为是一种慢性炎症代谢性疾病，由血管内皮处脂质异常堆积和炎性细胞浸润引起。有相关文献报道动脉粥样硬化发生的第一步是内皮损伤和功能障碍，并用临床证据和实验数据证明了睡眠障碍、内皮功能障碍和 CVD 之间存在密切联系，其具体潜在机制仍有待阐明。小片段RNA具有重要的结构、催化和调控作用功能，并可能影响许多蛋白质编码基因的输出。miRNA作为外泌体的重要载体，最近已成为参与包括心血管疾病在内的各种疾病发病机制的关键调节因子。然而，目前关于miRNA在对睡眠调节动脉粥样硬化形成的分子机制知之甚少。
本研究从睡眠剥夺或睡眠未剥夺的志愿者、睡眠剥夺12周的小鼠或同窝对照的血浆中分离循环外泌体，进行miRNA芯片以确定循环外泌体中miRNA表达的变化，并结合转录组学技术探讨了循环外泌体在睡眠剥夺状态下内皮炎症和动脉粥样硬化形成中的潜在分子机制。研究结果揭示了一种新的内源性促动脉粥样硬化机制，即慢性睡眠剥夺衍生的循环外泌体通过miR-182-5p 促进内皮炎症和动脉粥样硬化形成。
Result1 十二周的睡眠剥夺加重了 apoE−/− 小鼠的动脉粥样硬化
本研究对易患动脉粥样硬化的 apoE-/- 小鼠进行 12 周的慢性睡眠剥夺（SD）。结果显示，体重、血浆总胆固醇 (TC)、甘油三酯和血压没有变化；与对照组相比，小鼠的动脉粥样硬化病变逐渐变大，12周的睡眠剥夺加重了动脉粥样硬化。
Result2 睡眠剥夺后小鼠和人类血浆外泌体的表征和体外功能验证
为了详细说明睡眠剥夺后小鼠和人类血浆外泌体的功能，本研究从睡眠剥夺小鼠 (SD) 和睡眠控制小鼠 (SC) 的血浆中分离外泌体，纳米粒子追踪分析显示 SC-exo 和 SD-exo 之间的粒径分布或血浆浓度没有显着差异。进一步用 PKH67 标记的外泌体孵育培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)，观察到外泌体在孵育 12 小时后被 HUVEC 内化。随后，该团队还评估了 SC-exo 和 SD-exo 对 ox-LDL （氧化低密度脂蛋白）或脂多糖 (LPS) 诱导的内皮细胞损伤的影响，结果表现为细胞活力降低；内皮细胞凋亡、IL-1β 和 IL-18 的释放增加。重要的是，还发现 SC-exo 保护细胞免受 ox-LDL 或 LPS 诱导的损伤，而 SD-exo 则失去了这种保护作用。
此外，该团队还探索了睡眠剥夺对人类循环外泌体的影响。上夜班工作1年以上的健康女护士7名（曾在深夜工作≥3小时）为实验组，并招募了 8 名女性作为对照组。与对照组相比，夜间工作者增加了 ox-LDL 或 LPS 处理的 HUVEC 中 IL-1β 和 IL-18的释放。结果表明睡眠剥夺衍生的血浆外泌体在 ox-LDL 或 LPS 损伤的内皮细胞中发挥促炎和促凋亡作用。
图2 | 睡眠不足小鼠和人类血浆外泌体的功能验证
Result3 注射睡眠剥夺衍生的循环外泌体增加动脉粥样硬化斑块面积并增强 apoE-/- 小鼠主动脉的炎症
为了进一步了解睡眠剥夺者衍生外泌体（SD-exo ）在体内的促炎和动脉粥样硬化促进作用，该团队将SD-exo或SC-exo从野生型C57BL/6J小鼠的血浆中分离出来，腹膜内注射到 apoE-/- 小鼠中，结果显示SC-exo治疗可显著降低整个主动脉和主动脉弓中动脉粥样硬化斑块的数量和大小，SD-exo治疗则可逆转这一现象。组织学分析显示，SD-exo 治疗小鼠的病变、巨噬细胞和胶原蛋白明显增多，并且与 IL-18 和 IL-1β 相关的炎症表型在 SD-exo 处理后的小鼠主动脉组织中显着上调。这些发现表明，与 SC-exos 相比，SD-exos 具有促炎和促动脉粥样硬化作用。
图3 | 睡眠剥夺小鼠血浆中分离出的外泌体增加了动脉粥样硬化斑块面积并增强 apoE-/- 小鼠主动脉的炎症
Result4 miR-182-5p 是 SD-Exo 诱导的内皮细胞损伤的关键成分
为了确定SD-exo促炎作用的成分，本研究采用miRNA芯片进行了SD-exo和SC-exo的miRNA差异分析。结果共检测到14种差异表达的miRNA（FC>2.0；P<0.05），并且发现miR-182-5p抑制剂显著降低了用ox-LDL和SC-exo处理的HUVEC中的细胞活力，增加了细胞凋亡，并增强了IL-18和IL-1β的释放。为了更好地了解外泌体miR-182-5p的功能，课题组评估了用血浆外泌体处理的HUVEC中miR-182-5p的水平。结果发现SD-exo孵育48小时的HUVEC中miR-182-5p水平显著降低。此外，miR-182-5p的加入显著减弱了SD-exo的促炎和促凋亡作用。值得注意的是，本课题组还研究了慢性睡眠剥夺是否会降低人类受试者的血浆外泌体miR-182-5p。结果显示，夜班护士在夜班工作1年后的血浆外泌体miR-182-5p水平下降了1.9倍，miR-182-5p的添加显著减弱了夜班外泌体的促炎作用。综合来看，这些结果都表明miR-182-5p在SD-exo诱导的内皮细胞炎症和凋亡中起着关键作用。
图4 | miR-182-5p 的减少对于睡眠剥夺衍生的循环外泌体提供的促炎作用至关重要
Result5 miR-182-5p 通过靶向内皮细胞中的 MYD88 发挥抗炎作用
为进一步了解miR-182-5p的作用，该研究团队用ox-LDL处理HUVEC 12小时，随后SC-exo或SD-exo处理12小时，进行转录组测序。基于可能的 miR-182-5p 靶基因和内皮细胞中的转录组测序结果，最终聚焦于参与炎症和细胞凋亡途径的 MYD88，并发现 miR-182-5p 模拟物显著降低了 MYD88蛋白水平，而 miR-182-5p 抑制剂增加了 HUVEC 中的 MYD88。同时，NF-ĸB 的磷酸化和 MYD88 的 2 个下游基因 NLRP3 的表达被 miR-182-5p 模拟物降低并被 miR-182-5p 抑制剂升高。此外，通过 siRNA 沉默下调 MYD88 蛋白显著降低了 HUVEC 中 ox-LDL 诱导的 IL-18 和 IL-1β 的释放，这些结果进一步表明 miR-182-5p 通过靶向内皮细胞中的 MYD88 发挥抗炎作用。
图5 | MYD88是miR-182-5p在内皮细胞中的靶基因
Result6 睡眠剥夺状态下外泌体miR-182-5p水平的降低与小肠上皮有关
Result6.1 睡眠剥夺使小肠上皮细胞miR-182-5p的表达减少
为了探索睡眠剥夺诱导的循环外泌体miR-182-5p减少的起源，本研究检测了成熟miR-182-5p及其前体pre-miR-182-5p的表达。发现在 8 周睡眠剥夺后，肠道、骨骼肌和主动脉中的成熟 miR-182-5p 和 pre-miR-182-5p 均显著降低，并且8 周的睡眠剥夺不仅减少了小肠上皮细胞中的成熟和前体miR-182-5p，而且还减少了 SIE 衍生的外泌体中的 miR-182-5p。
图6.1 | 睡眠剥夺使小肠上皮细胞miR-182-5p的表达减少
Result6.2 睡眠剥夺引起的褪黑激素减少可能导致小肠上皮细胞中 miR-182-5p 表达下调
为了研究褪黑激素对 miR-182-5p 产生的作用，将培养的人肠上皮细胞暴露于褪黑激素，发现褪黑激素增加了人肠上皮细胞中的成熟和前体miR-182-5p，还增强了人肠上皮细胞外泌体 miR-182-5p的分泌。此外，体内研究也显示睡眠剥夺小鼠的血浆褪黑激素水平降低。有趣的是，进一步研究发现睡眠剥夺诱导 ROS 在肠道中积累，并且给予褪黑激素可以减轻睡眠剥夺小鼠的氧化应激，表明ROS可能在褪黑激素提供的miR-182-5p产生中发挥作用。
图6.2 | 睡眠剥夺引起的褪黑激素减少可能导致小肠上皮细胞中 miR-182-5p 表达下调
Result7 miR-182-5p的减少在睡眠剥夺诱导的体内动脉粥样硬化中是必要的
为了探索 miR-182-5p 在体内睡眠剥夺诱导的动脉粥样硬化形成中的作用。该团队将睡眠剥夺的 apoE-/- 小鼠用特异性模拟 miR-182-5p 功能的 miR-182-5p agomiR 治疗，发现注射 agomiR 增加了 SIE 中的 miR-182-5p 表达。与体外结果一致，在 agomiR 处理后小鼠主动脉组织中炎症表型，包括 MYD88、NLRP3、IL-1β 和 IL-18的表达减少。重要的是，与对照组相比，agomiR 治疗显着降低了整个主动脉和主动脉弓中动脉粥样硬化斑块的数量和大小。综上所述，这些结果揭示了 miR-182-5p 在睡眠剥夺诱导的 apoE-/- 小鼠动脉粥样硬化斑块形成和进展中的重要作用。
图7 | miR-182-5p的减少对睡眠不足诱导的斑块形成至关重要
本研究报告了循环外泌体通过 MYD88/NF-ĸB/NLRP3 通路的 miRNA 依赖性上调参与睡眠剥夺引起的动脉粥样硬化。揭示了在睡眠剥夺和动脉粥样硬化的背景下由外泌体介导的小肠上皮-动脉通讯。证实了循环外泌体及其包含的 miRNA 可能是动脉粥样硬化发展的有前途的模仿睡眠剥夺的候选者，阐明了代谢性心血管疾病发展的潜在机制。
【参考文献】
Li, Xiao, et al. Sleep Deprivation Promotes Endothelial Inflammation and Atherogenesis by Reducing Exosomal miR-182-5p. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, 10.1161/ATVBAHA.123.319026. 6 Apr. 2023, doi:10.1161/ATVBAHA.123.319026
