为什么有必要在植物中做单细胞测序
如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的吸引力。那么为了理解这个问题，我们换个方式提问，在植物中为什么非要用单细胞测序不可？
世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异可大可小。但是当老师的样本存在下图这样一个情况，组织中不同细胞的基因和蛋白表达不同，为了检测组织中蛋白或mRNA的表达水平，老师们可以通过Western blot和PCR或Bulk RNA-seq来实现。
但是用上述方法的话，老师们并没有办法区分这些的情况：目的蛋白只在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达呢？
举个例子，当老师送的植物样本，一个基因（gene1）可能在分生组织中上调了，在保护组织中下调了，但是bulk RNA 测序结果发现没有区别，这样的没有区别其实是个假阴性，老师可以通过单细胞测序找出这种区别，进行更为深入的研究。单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术提供了在单细胞水平上观测基因表达的方法，这样可以更好地研究这些组织中不同的细胞类型。
那么我们为什么要在植物中做单细胞测序呢？我们可以看大这里展示的拟南芥以及水稻的根组织，他们所包含的细胞类型是有一个很大的异质性的，而同样拟南芥中，根组织和叶片组织细胞类型也是不同的，同一组织不同细胞类型间同样具有不同的基因表达模式，这些异质性我们是可以借助单细胞测序技术进行深入研究的。
植物中单细胞测序实际应用
随着单细胞测序技术的突破，单细胞测序的时代已然到来。其技术已经大量发表在CELL、Nature、Science等高质量期刊中，其中大多数集中在人和动物方面。近年来，单细胞测序在植物方向上的应用也在逐步扩大，涉及的物种包括拟南芥、水稻，以及玉米，本文就带大家一起看一下由欧易生物助力发表的植物相关单细胞测序文章。
首先是河南大学孙旭武教授课题组在 Molecular Plant 杂志发表的一篇研究拟南芥气孔谱系细胞发育进程的文章。
Molecular Plant ( IF 21.949 ) ；
Pub Date : 2020-06-24；
材料：5 日龄拟南芥幼苗子叶中分离的原生质体；
技术： 10×Genomics scRNA-seq、单细胞转录组测序
这篇文章思路首先是一个常规的细胞类型的鉴定，通过文献调研作者最终定义了9种细胞类型，以及另外两种不能使用已知的标记基因来确定的细胞类型。热图和小提琴图分别对top10的基因进行展示。
由于植物marker基因鉴定尚不成熟，所以作者为了验证top10 marker基因的可靠性，采取了以下2种验证，第一种方法通过研究top10的分子功能来推测细胞功能。作者构建了bag6和bzip6的突变株，发现bag6突变株表面气孔指数增加，推测BAG6参与调控气孔的发育，进而推测Cluster 9是一群参与调控气孔的发育的细胞。
以下是第二种验证top10 marker基因的可靠性的方法:
2015年，Adrian那篇文章是用流式把拟南芥子叶分成了几类细胞，然后回收这些细胞去做测序，公布了测序数据集给大家用。这篇文章就是把Figure2A中top 10基因挑出来，看看这些基因在人家的哪个细胞类型的数据集中表达了。简单来说是把Figure2A中top10的marker基因，映射到这两篇文章中，看看这些基因在这两篇文章中是不是也在同一个细胞类型在表达。
世上本无marker基因，top10基因用的人多了，也就变成了marker基因。举个例子，PC（扁平表皮细胞）他没有特定的标志基因，这篇文章他把鉴定到的PC高表达基因和人家数据集比对，比对到了40%，也进一步可以说明细胞类型鉴定的可靠程度。
既然作者都用这么多方法证明了细胞类型鉴定的可靠性了，那么就可以放心开展接下来的研究了。为了发现参与调节气孔谱系细胞早期发育的潜在TF，作者统计了在不同细胞类型中显示高表达的TFs。unknown (u.k.)_1 中 TFs数量最多，MPC_5中TFs数量最少。不知道大家记不记得，通过文献调研作者最终定义了9种细胞类型，以及另外两种不能使用已知的标记基因来确定的细胞类型。
Cluster 9这群不为人知的细胞前面作者已经推断好了，他是参与调控气孔的发育的细胞。这里发现Cluster 1是一群参与气孔早期发育的基因。那话不多说我们接着看下去。
MMC，LM，EM和GMC均是气孔的发育早期的重要细胞。因此作者着重研究MMC，LM，EM和GMC四种细胞共表达基因的转录因子调控网络。分析结果表明ATML1, BPC1, BPC6, SCRM, PIF5,and WRKY33 可能是调控MMCs、EMs、LMs和GMCs中靶基因的表达的核心转录因子。
通过文献调研，发现BPC蛋白和WRKY33是参与调节幼苗生长发育和胁迫反应的重要TFs。而BPC1，BPC2，BPC4，BPC6和WRKY33的表达在MMC，LM，EM和GMC中表达也相对很高。
综合这些因素，于是作者又研究了BPC蛋白、WRKY33和这次鉴定到的共表达转录因子和已知关于这四种细胞的转录因子之间的调控关系。结果发现BPC1和BPC6可能通过这些相互作用调控早期气孔谱系细胞的发育。
为了研究已鉴定的TFs对气孔谱系细胞发育的影响，作者分析了它们的表达特征图。发现BPC1、BPC2、BPC4和BPC6的表达主要在MMCs、EMs和GMCs中增强，而WRKY33在所有细胞类型中均可检测到表达。于是作者构建了WRKY33突变株，发现WRKY33突变株的M 和 GMC 细胞比例上升，但 GC 细胞比例下降，表明 BPCs 蛋白可能参与介导 M 到 GMC 的发育过程，从而促进气孔谱系早期发育。作者构建了BPC突变株，也发现了同样的规律。
最后为了分析气孔分化过程中的发育轨迹，作者使用 Monocle 2 软件对 scRNA-seq 单细胞转录组测序数据进行了拟时序分析，拟时序路径共有三个分支。总体来看，从 MMC 到 GC 可以看到气孔谱系细胞的不同发育过程。
这篇文章作者对拟南芥气孔谱系细胞发育过程进行了单细胞转录组测序分析，鉴定了气孔发育过程中各细胞类群显著表达的 marker gene，并分析了其所参与的 GO 功能。为了分析气孔细胞早期发育阶段的基因表达调控机制，构建了气孔分生母细胞中基因表达的转录因子调控网络。进一步通过分析所鉴定的标记基因和转录因子的拟南芥突变体的气孔发育表型，确定了这些基因在调控气孔发育中所扮演的重要角色。这项研究为利用单细胞RNA-测序技术在鉴定新的标记基因，以及解析气孔谱系细胞发育的调控机制提供了新的研究思路和技术体系。
接下来这篇文章是福建农林大学等单位的研究人员在水稻叶片原生质体中构建了TF（OsNAC78）的差异表达系统，对构建好的原生质体进行scRNA-seq。
Frontiers in Plant Science (IF 6.627)；
Pub Date : 2020-11-16；
材料：MH63水稻幼苗原生质体；
技术：10×Genomics scRNA-seq单细胞测序
这篇文章老师重点是利用单细胞测序来筛选转录因子的一个靶基因。
老师为了研究OsNAC78这个转录因子的靶基因，将OsNAC78过表达到MH63水稻幼苗中，对照组为野生型MH63水稻幼苗。
通过对OsNAC78高表达的细胞进行细胞亚型分析，发现cluster1和cluter4一个是表达OsNAC78最多的cluster一个是表达OsNAC78最少的cluster。
于是作者针对cluter1和4做了一个差异分析，将cluster4中上调的19个候选基因基因单出拎了出来。
随后作者通过过表达OsNAC78，看看有哪些基因可以随着OsNAC78的过表达也跟着上调。结果筛选出了两个基因。然后我们通过文献调研等手段构建了一些Os01g0934800 和 Os01g0949900启动子的报告质粒，然后酵母单杂来筛OsNAC78会和哪个启动子结合，找到启动子后。作者又做了EMSA和荧光素酶报告实验，验证了一下Os01g0934800 和 Os01g0949900确实是OsNAC78的靶基因。
2022年2月26日，河南大学孙旭武教授团队在The Plant Journal 杂志发表了一篇通过对拟南芥幼苗子叶的单细胞测序，揭示了子叶叶脉的早期发育动态的文章。
The Plant Journal ( IF 7.091 )；
Pub Date : 2022-02-26；
材料：拟南芥3天龄子叶原生质体；
技术：10×Genomics scRNA-seq单细胞转录组测序
这篇文章作者重点关注叶脉的发育调控机制，其中涉及到一些筛选叶脉发育中被激活基因的方法（方法1：通过每组top10的基因，构建基因突变株进行筛选；方法2：通过研究重点关注细胞类型中的转录因子调控网络，筛选出核心的转录因子，构建基因突变株进行筛选）。
这篇文章思路首先是一个常规的细胞类型的鉴定，通过文献调研作者最终定义了9种细胞类型，以及另外1种不能使用已知的标记基因来确定的细胞类型。
将每个cluster间的差异表达基因去做了富集分析，也进一步可以说明细胞类型鉴定的可靠程度。
为了筛选叶脉发育中被激活基因，作者将每个cluster中top 10的基因构建基因的突变株，随后进行叶脉发育的实验，结果表明，红框圈出来的基因在叶脉发育过程中被激活。
为了进一步分析子叶叶脉的发育调控机制，研究接下来分析了特定组织细胞的转录因子调控网络。在 PP、CC_4 和 XP 中鉴定到的核心转录因子分别是CDF5、ERF15 和 RGA。通过比对别人文章的DAP-SEQ(DNA亲和纯化测序)，发现CDF5 靶基因。随后对CDF5 靶基因进行 GO 富集分析。通过对野生型和CDF5 突变植株叶片中CDF5下游靶基因进行qRT-PCR，发现突变体中CDF5 靶基因会下调，也进一步验证了DAP-SEQ的结果。构建CDF5基因突变株，叶脉发育的实验表明，CDF5的基因在叶脉发育过程中被激活。
最后作者为了了解叶脉分化过程中的发育轨迹，使用 Monocle 2 软件对 scRNA-seq单细胞转录组测序 数据进行了拟时序分析，并且通过RNA速率分析验证，发现BS、XP和CC_8簇中细胞的RNA速度发生了很大的变化，认为这些cluster代表快速分化的细胞。与拟时分析结果一致，BS、XP和CC_8在拟时间后期富集，有可能与叶脉发育有关。同时拟时分析热图也展示了基因表达沿着拟时间轴的变化。
接下来是南繁种业所生物育种研究室发表的一篇玉米根尖细胞的单细胞转录组文章。
The Crop Journal ( IF 4.407 )；
Pub Date : 2022-03-09；
材料：B73-玉米幼苗根原生质体；
技术：10×Genomics scRNA-seq单细胞转录组测序
作者为了识别硝酸盐胁迫条件下，特异性硝酸盐反应基因。利用含（硝酸盐+）或不含硝酸盐（硝酸盐-）的培养液中生长的玉米根的单细胞转录组进行了分析。
这篇文章首先还是一个细胞类型的鉴定，F图是一个marker基因的展示图，G图他是展示了不同聚类与中柱鞘和根毛的相关性气泡图，发现cluster8与中柱鞘的相关性程度高，而cluster5与根毛相关性程度高，也是符合细胞类型鉴定的一个结果的。Fig2给每个细胞类型做了一个功能富集分析。
于是乎作者利用slingshot algorithm研究了表皮和根毛的分化轨迹。可以看出根毛细胞是从表皮细胞分化而来的。对轨迹中100个最重要的基因根据基因表达模式进行层次聚类，聚类后得到了两个gene cluster。很显然gene 2 cluster 在两个分支上是差异相对比较大。于是乎作者对这群基因又做了一次富集分析。这些结果并反映了根表皮细胞分化过程中的转录重组信息，从而再现了根毛的发育过程。
文章的最后作者还把玉米的根和三个品系的水稻根但细胞转录组数据（文献调研）进行了比对，C图 发现了58个核心同源基因（保守基因）在两个物种的根毛中均有高表达，并对这些基因进行富集分析，发现这些基因参与了根毛和表皮细胞的发育。D图玉米和水稻分离根细胞的UMAP可视化。
最后，由于植物细胞原生质体解离的成功对植物的生长状态有较高要求，为确保植物取样部位新鲜，我们建议老师把生长状态良好的活体植株直接运输，取材前与我们实验室技术人员沟通好具体的取材部位和注意事项，将由小欧继续培育植物样本到实验结束。
目前我们成功解离的植物样本也是琳琅满目（油橄榄、土豆、石斛、茶树、桑树、葡萄、大蒜、大豆、水稻等）… …快要能够开一个小小的植物园了！
原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载
