前言
2022年9月12日，来自南京大学化学和生物医药创新研究院的团队，于ACS Applied Materials & Interfaces（IF：10.383）在线发表了砷烯纳米片在肿瘤微环境中免疫调节作用的最新研究成果。该研究通过体内和体外实验，单细胞转录组测序(scRNA-seq)和蛋白质组学分析，全面阐释了砷烯在肿瘤微环境中的作用机制，首次发现砷烯的免疫调节作用，为未来的免疫治疗提供了一个很有前途的策略。
研究背景
砷烯是一种由坤烯组成的二维单元素层状纳米片，具有显著的抗癌活性，但具体的生物学机制仍是未知的。通过单细胞转录组分析肿瘤微环境中的细胞表型，该研究发现砷烯可以招募高比例的抗癌免疫细胞，重塑肿瘤微环境，从而清除肿瘤。在体内，砷烯可以激活T细胞受体信号通路来产生抗肿瘤免疫细胞，并抑制肿瘤细胞的DNA复制和TCA循环通路。肿瘤细胞的蛋白质组学分析显示，砷烯通过靶向硫氧化还原蛋白TXNL1来诱导活性氧产生和氧化应激损伤。在濒死的肿瘤细胞中，超负荷的活性氧（ROS）进一步触发内质网应激反应，释放损伤相关分子模式（DAMPs）和“吃我”信号，激活抗原呈递过程，诱导后续效应肿瘤特异性CD8T细胞免疫反应。该研究首次发现，二维无机纳米材料砷烯可以有效激活直接的抗癌免疫反应，表明砷烯可以作为未来抗肿瘤免疫治疗的候选纳米药物。
基本信息
期刊：ACS Applied Materials & Interfaces
影响因子：10.383
发表年月：2022年9月12日
材料：砷烯和PBS处理过的U14荷瘤小鼠肿瘤组织
方法：10X Genomics高通量单细胞转录组测序
研究结果
1.砷烯对宫颈癌的体内、体外抗肿瘤作用
作者采用液体超声剥离法合成了二维砷烯纳米片，平均尺寸为138.4 nm，尺寸分布范围约为84.7 ~ 198.4 nm。用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、拉曼光谱和宽扫描x射线光电子能谱(XPS)以及原子力显微镜(AFM)对纳米片进行了表征(图1a−c)。作为活性氧(ROS)靶向的纳米材料，砷烯已被报道能产生类似芬顿的反应性质。在不同浓度的砷处理后，1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)和亚甲基蓝(MB)降解显著，证实了砷烯纳米片催化的类芬顿反应(图1d)。
在24、48、72 h检测不同浓度的砷烯对小鼠宫颈癌细胞系U14、小鼠乳腺癌细胞系4T1、小鼠胃癌细胞系MFC、小鼠正常细胞系MC3T3-E1和NCTC -1469的细胞毒性。结果表明，砷烯在24 h时对U14细胞的抑制作用最强，IC50值为0.5798 μg/mL，而在低浓度时对正常细胞系NCTC-1469无毒性(图1e - f)。考虑到砷烯在体外催化的类芬顿反应，作者研究了细胞内ROS的产生。通过流式细胞术检测，在砷烯处理后U14癌细胞中观察到ROS的爆发产生，而正常NCTC-1469细胞中未观察到ROS的产生（图1h）。此外，作者还使用阳离子脂类荧光染料(JC-1)检测了线粒体跨膜电位(MMP)，对U14细胞中形成的单体和聚集体的成像显示，线粒体去极化是由砷烯诱导的(图1g)。凋亡实验证实了砷烯在U14细胞中诱导凋亡细胞死亡(图1i)。
鉴于砷烯在细胞内具有良好的抗癌作用，作者研究了其在体内的抗肿瘤活性。在BALB/c雌性小鼠中构建小鼠U14肿瘤模型，注射砷烯纳米片(1.5 mg kg)。注射后24 h，观察到肿瘤组织中砷烯的生物分布(图1j)。与PBS组相比，砷烯组表现出了优异的抗肿瘤效果(图1k−l)。砷烯对肿瘤的相对抑制率约89%，小鼠20天存活率为100%(图1m)。肿瘤切片的H&E染色也显示出砷烯的显著抑制作用(图1n)。
图1 | 砷纳米片的表征及其抗肿瘤活性
2. 对肿瘤微环境进行单细胞转录组测序，揭示砷烯的免疫激活作用
为了更好地说明砷烯在肿瘤微环境中的作用，作者对砷烯和PBS处理过的小鼠肿瘤组织进行了单细胞转录组测序 (图2a)。初步质量控制后，PBS组获得12344个细胞，砷烯组获得10598个细胞。基于基因表达谱的主成分分析，识别出了17个具有特定基因表达谱的细胞簇。砷烯处理后肿瘤微环境中免疫细胞富集比例较高，PBS处理后肿瘤区免疫细胞富集比例较低(图2b)。在砷烯处理组中，T细胞占41.51%，B细胞占20.5%，NK细胞占8.96%，巨噬细胞占6.75%，肿瘤上皮细胞占2.46%。而PBS组中，肿瘤中上皮细胞的比例为87.25%，免疫细胞的比例仅为0.25%，B细胞比例为0.03%，并未观察到NK细胞(图2c)。表明，砷烯通过增强先天(NK细胞、B细胞和巨噬细胞的募集)和适应性(T细胞的募集)免疫反应，在重构肿瘤微环境中具有有效的免疫调节作用。
为了揭示基因水平的潜在机制，比较PBS组和砷烯组的表达基因水平。通过KEGG富集分析，发现砷烯处理后小鼠的抗原加工和递呈、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性均被激活，提示砷烯具有明显的免疫激活能力(图2d)。GSEA分析结果显示，砷烯激活的基因主要与抗原加工呈递途径、Th1和Th2细胞分化、自然杀伤细胞介导的细胞毒性过程和T细胞受体信号通路有关(图2e)。砷烯在肿瘤上皮细胞中显著抑制DNA复制、RNA运输、丙酮酸代谢和TCA循环过程(图2f)。抑制DNA复制和RNA运输直接限制了肿瘤细胞增殖，而砷烯对TCA循环过程中丙酮酸代谢的影响导致肿瘤呼吸链中断，能量耗尽。
综上所述，砷烯通过招募免疫T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞，增强肿瘤微环境中的先天和适应性免疫反应，具有高效的免疫调节能力。
图2 | 小鼠肿瘤微环境的单细胞转录组测序分析
3.体外和体内实验证实砷烯的免疫激活作用
如scRNA-seq所示，在肿瘤微环境中，砷烯激活抗原呈递和T细胞受体信号通路。在树突细胞（DC）成熟过程中，未成熟DC (iDCs)吞噬肿瘤释放到特殊受体的抗原。为了确定DC的激活过程，作者在体外检测DC的成熟，将砷烯处理的U14癌细胞与从BALB/c雌性小鼠骨髓中提取的iDCs共培养(图3a)。在Transwell系统中，U14细胞在上孔中培养，用砷烯处理6 h，然后与下孔中接种的iDCs共培养24 h。收集DC，检测DC成熟标记共刺激分子CD86和CD80的表达。结果显示，与PBS相比，砷烯显著促进DC (CD86/CD80)的成熟度，从0.8%提高到23.3%(图3c)。ELISA结果显示，砷烯显著促进了DC激活相关细胞因子TNF-α和白细胞介素-12 (IL12p70)的分泌 (图3b)。这些结果表明，砷烯能成功地在体外诱导DC成熟。
然后，作者评估了砷烯在体内的抗癌免疫激活。免疫小鼠构建U14肿瘤模型，尾静脉注射砷烯处理24 h后，收集肿瘤引流淋巴结，流式细胞术分析DC的成熟情况。成熟DC的表达量从0.855%增加到33.7%(图3d)，而且砷烯也能促进白细胞介素12的分泌(图3e)。这些结果表明，砷烯能有效地触发体内抗原呈递过程。进一步检测效应CD4 T细胞和CD8 T细胞，流式细胞术检测结果显示，PBS和砷烯处理小鼠CD4 T细胞的百分比分别为3.82%和6.26%，CD8 T细胞的比例分别为1.98%和10.21%(图3f,g)。与PBS组相比，砷烯组T细胞数量减少到约7.12%（图3h,i），说明砷烯可以有效改善免疫抑制微环境。这些结果表明，砷烯能诱导效应抗肿瘤T细胞在肿瘤微环境中的募集，这与scRNA-seq分析显示的大量T细胞在肿瘤微环境中的募集一致。另外，作者不但证实砷烯可以激活的DC和T细胞，又进一步证实了巨噬细胞的极化。
图3 | 体内外实验证实砷的免疫激活作用
4. 砷烯处理诱导的免疫记忆反应
为了进一步确定砷烯诱导的抗肿瘤免疫记忆反应，作者采集脾脏并检测记忆相关T细胞的变化。在小鼠中，根据CD44和CD62L的表达，记忆T细胞可分为naïve和记忆细胞。记忆T细胞通过CD44高表达和CD62L低表达进行鉴定。与野生型小鼠相比，砷烯处理小鼠脾脏的naïve T细胞比例降低，而效应记忆T细胞(TEM)和中枢记忆T细胞(TCM)则明显增加(图3j)。此外，对于砷烯治疗的U14荷瘤BALB/c小鼠，当第二次肿瘤植入7天后，具有免疫记忆的小鼠均未出现肿瘤复发，而野生型小鼠肿瘤复发(图3k,l)。这些数据表明，砷烯确实可以诱导强烈的免疫记忆反应，有效地防止肿瘤的复发。砷烯处理后产生的有效抗癌T细胞和免疫记忆显示了砷烯在未来生物医学应用中强大的免疫治疗潜力。
5. 蛋白质组学分析揭示砷烯在癌细胞中的作用机制
为了探索上述观察到的免疫激活，作者对U14肿瘤细胞进行了蛋白质组学分析。经砷烯处理后，质谱分析发现细胞中存在显著差异表达的蛋白。其中，增加了146个蛋白的表达，减少了154个蛋白质的表达(图4a)。有趣的是，U14细胞中表达下调的Top蛋白是硫氧还蛋白样蛋白-1 (TXNL1)，这是一种具有二硫氧化还原酶活性的硫氧还蛋白，参与调节氧化应激，保护细胞免受氧化损伤。TXNL1表达的快速下调导致癌细胞发生氧化还原紊乱和急性细胞凋亡，不可避免地导致癌细胞氧化还原失衡。因此，砷烯诱导的ROS爆发可能与细胞内TXNL1蛋白失活有关。Western blot实验证实，由此产生的氧化应激进一步提高了保护蛋白HMOX1和hsp70的表达(图4c)。
为进一步分析砷烯对癌细胞细胞通路的影响，作者进行了生物信息学分析。KEGG分析表明，砷烯能激活抗原呈递过程和内质网(ER)的蛋白质生产过程 (图4b)。由此可见，在蛋白质组水平上，在癌细胞中，砷烯抑制硫氧还蛋白TXNL1产生致死性氧化应激，并进一步激活氧化应激相关蛋白的过表达，参与ER过程和抗原呈递途径。
ROS的产生和内质网(ER)应激对激活细胞内免疫原性细胞死亡(ICD)途径至关重要。ICD依赖于诱导肿瘤细胞内ROS产生的内质网应激反应，结合细胞凋亡和损伤相关分子模式(DAMPs)的释放，促进抗肿瘤免疫反应。在这一ICD过程中，ROS激活了DAMP信号通路，包括暴露在细胞表面的钙网蛋白(CRT)、释放高迁移率组蛋白(HMGB1)和凋亡分泌ATP。从砷烯诱导的细胞死亡的形态中可以观察到死亡细胞和内源性内容物的释放(图4d)。然后，通过分析培养基中释放的内容，检测砷烯处理癌细胞的培养基上清液中ATP、HMGB1等DAMPs的释放(图4e,f)。
此外，热休克蛋白70 (HSP70)和ICD标记钙网蛋白等DAMP在砷处理的死亡细胞中过表达(图4g)。CRT作为ICD的指标，以及“吃我”信号，刺激iDCs和巨噬细胞吞噬死亡肿瘤细胞的碎片。免疫荧光进一步验证显示，U14细胞中CRT表达显著升高(图4h)。HMGB1作为一种危险信号，可刺激树突状细胞的吞噬。与未处理的细胞核中HMGB1的绿色信号相比，砷烯能显著诱导U14细胞中HMGB1的胞外释放（图4i）。这些结果表明，砷烯可诱导免疫原性细胞死亡和DAMPs释放，释放的DAMPs进一步诱导抗原提呈细胞成熟。
图4 | 砷烯处理U14癌细胞的蛋白质组学分析、ICD诱导和DAMP释放
总的来说，在癌细胞中，砷烯通过靶向TXNL1诱导ROS的产生和氧化应激损伤。超负荷的ROS进一步触发内质网应激反应，濒死肿瘤细胞释放DAMPs和“吃我”信号，从而激活抗原提呈过程，进而促进抗原提呈DCs的成熟，诱导后续的效应性肿瘤特异性T细胞免疫反应(图5)。
图5 | 通过蛋白质组学分析和单细胞测序分析，分别绘制了砷烯在癌细胞和肿瘤微环境中的免疫调节过程示意图，揭示了砷烯纳米片意想不到的免疫调节潜力
研究结论
作者通过单细胞转录组测序和蛋白质组学分析，全面分析了砷烯在体内和体外的作用机制，首次发现了砷烯意想不到的免疫调节能力。肿瘤组织的单细胞转录组测序分析显示，砷烯通过在肿瘤区域招募高比例的免疫细胞，重塑了肿瘤微环境。肿瘤细胞的蛋白质组学分析显示，砷烯通过靶向硫氧化还原蛋白TXNL1来诱导活性氧产生和氧化应激损伤。在濒死的肿瘤细胞中，超负荷的活性氧（ROS）进一步触发内质网应激反应，释放损伤相关分子模式（DAMPs）和“吃我”信号，激活抗原呈递过程，诱导后续效应肿瘤特异性CD8T细胞免疫反应。
因此，体内发现的抗肿瘤免疫调节源于砷烯处理死亡癌细胞释放的特殊信号，这一过程进一步触发了初始和适应性免疫反应；这一意外发现首次表明，二维单元素材料可以有效激活直接的抗癌免疫反应，为未来的免疫治疗提供了一个很有前途的策略。
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