前言
老龄化相关疾病的患病率高、预后较差。而探寻合适的衰老模型，预防衰老相关性疾病具有重要意义。文章通过研究小鼠甲状腺毒症与衰老的关系，采用LC-MS、GC-MS非靶代谢组学及DIA蛋白质组学结合的方法，分析内源性代谢组和血清蛋白质组的变化。为甲状腺毒症小鼠衰老模型的建立及探索抗衰老药物研发提供新思路。
2022年06月，鲁南制药集团股份有限公司冯芹和张贵民研究员课题组在Frontiers in Immunology期刊发表了题为 “The Aging Features of Thyrotoxicosis Mice: Malnutrition,Immunosenescence and Lipotoxicity ”的研究成果，通过LC-MS、GC-MS非靶代谢组学和DIA蛋白质组学研究方法，描绘了血清蛋白质组和内源性代谢图谱，发现了小鼠甲状腺毒症与衰老特征，探究了甲状腺毒症与衰老疾病的机理，为探究衰老机制及抗衰老药物的研发提供了理论依据。
中文标题：甲状腺毒症小鼠的衰老特征：营养不良，免疫衰老与脂毒性
研究对象：小鼠
发表期刊：Frontiers in Immunology
影响因子：8.786
发表时间：2022年6月
合作单位：鲁南制药集团股份有限公司
运用生物技术：LC-MS非靶代谢组学、GC-MS非靶代谢组学、DIA蛋白质组学（由欧易/鹿明生物提供技术支持）
研究思路
研究方法
1. 实验分组
（1）对照组：雌性KM小鼠
（2）模型组：雌性KM小鼠+口服甲状腺素片混悬液
2. 技术路线
2.1血常规检查：EDTAK2抗凝剂、自动血液分析仪、流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的阳性率、PerCP-Cy™5.5小鼠外周血CD3、FITC 标记大鼠抗小鼠CD4抗体、APC-H7大鼠抗小鼠CD8a、PE大鼠抗小鼠IFN-γ
2.2 CD4+IFN-γ+T淋巴细胞检测：IFN-γ+T淋巴细胞、CytoFLEX流式细胞仪
2.3血清生化分析：BS-800全自动生化分析仪
2.4血清蛋白质组测定：DIA-MS
2.5 血清LC-MS非靶代谢组学：ACQUITY UHPLC联合AB SCIEX Triple TOF 5600
2.6 血清GC-MS非靶代谢组学: Agilent 7890B GC联合Agilent 5977A MSD
2.7 粪便LC-MS非靶代谢组学：Dionex Ultimate 3000RS UHPL
3.统计分析：
ANOVA、a log-rank test、DIA、OPLS-DA 、S- t检验、Pearson correlation、R软件、Metascape、STRING、progenesis Q、CytExpert、Spectronaut Pulsa
研究结果
1、不同血细胞计数和生化指标的变化
血常规检测结果显示白细胞（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、淋巴细胞总数（淋巴）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB），红细胞压积（HCT）和血小板（PLT）均下降，表明过量甲状腺素会引起全血细胞减少（表1）。
小鼠连续摄入过量甲状腺素20天后，转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）显著升高，表明小鼠有肝损伤。总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（Glb）水平显著降低，表明过量的甲状腺素导致低蛋白血症或低白蛋白血症。总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDC-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著降低，而甘油三酯（TG）水平显著降低显著升高，表明甲状腺毒症小鼠有低胆固醇血症、低脂血症和高脂血症。
表1 | 甲状腺毒症小鼠不同血细胞计数和生化指标的变化
2、淋巴细胞亚群和功能的变化
与正常对照组比，甲状腺毒症小鼠的CD3+CD4+百分比显著下降，而CD3+CD8的百分比显著增加，所以CD4+/CD8+的百分比下降明显。CD3+CD4+IFN-γ+的百分比也显著降低（图2）。
图2 | 淋巴细胞亚群和功能的变化
3、甲状腺毒症小鼠与正常小鼠血清蛋白质组比较分析
PCA分析表明，甲状腺毒症小鼠与正常小鼠两组之间有差异（图3A）。DIA蛋白质组学分析了甲状腺毒症小鼠中162种差异表达的蛋白（DEPs），其中6种上调，156种下调（图3B）。Metascape在线分析法对156种下调蛋白进行了分析（图3C）。
图3 | 比较蛋白质组学分析
STRING分析了补体、凝血级联、Alb和Ttr（图4A）。血液凝固通路和抗凝纤溶因子均被下调，而在这些下调蛋白中，32种与免疫系统相关，表明体液免疫应答下降。大量免疫球蛋白下调，表明适应性免疫系统也随之下降（图4B）。对Alb、Trf以及补体和凝血级联进行相关分析，结果表明Alb与补体和凝血级联中的DEPs呈正相关（图4C-D）。
图4 | 补体和凝血级联中下调的DEPs
通过STRING在线分析，发现许多DEPs与体内平衡有关，负责脂质运输、离子运输和维生素运输。它们的下调表明脂质、离子和化学物质的体内平衡被破坏，影响甲状腺毒症小鼠系统的多细胞有机体发育（图5A）。此外，下调的DEPs与多细胞生物的发育直接相关（图5B）。
图5 | 下调的DEPs与体内平衡和多细胞有机体发育有关
4、血清LC-MS代谢组学分析结果及其与蛋白质组学的相关性
甲亢组和正常组之间的OPLS-DA评分存在显著差异。基于LC-MS代谢组学鉴定并量化了血清中821种代谢物，其中157种为差异表达代谢物（DEMs）。
KEGG途径分析表明，DEMs富含类固醇激素生物合成、初级胆汁酸生物合成、胆汁分泌、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路等途径。在Alb和C1qb显著相关的条件下，LC-MS DEMs中筛选出20个DEMs，其中下调的DEMs与下调的DEPs呈正相关（图6）。
图6 | 血清LC-MS代谢组学分析及其与蛋白质组学的相关性
5、血脂代谢组学分析结果及其与蛋白质组学的相关性
基于Lipidmaps数据库，LC- MS代谢组学鉴定并量化了血清中3333种脂质代谢物，其中425种为差异表达代谢物（DEMs），包括240种上调和185种下调。血脂DEMs与DEPs进行相关性分析，在与Alb和C1qb显著相关的条件下，筛选出13个脂质DEMs（图7）。
图7 | 血脂代谢组学分析及其与蛋白质组学的相关性
6、血清GC-MS代谢组学分析结果及其与蛋白质组学的相关性
甲亢组和正常组之间的OPLS-DA评分存在显著差异。GC-MS代谢组学鉴定并定量检测了885种血清中的代谢物，其中80种为差异表达代谢物（DEMs，13种上调，67种下调）。
KEGG途径分析表明， DEMs在蛋白质消化和吸收、氨酰tRNA生物合成、氨基酸生物合成、矿物质吸收、ABC转运体等途径中富集。Alb和C1qb同时显著相关的条件下，筛选出10了个脂质DEMs。其中，下调的DEMs与下调的DEPs呈正相关，上调的DEMs与下调的DEPs呈负相关。
图8 | 血清GC-MS代谢组学分析
7、粪便LC-MS代谢组学分析结果
甲状腺毒症组和正常组之间的OPLS-DA评分有显著差异。基于LC-MS代谢组学鉴定并定量了1820种代谢物，其中226种为差异表达代谢物（DEMs）。
KEGG途径分析表明，DEMs富含花生四烯酸代谢、甾体激素生物合成、亚油酸代谢、神经活性配体受体相互作用等途径。DEMs的分类表明，氨基酸、肽及类似物大多数被上调。在甲状腺毒症小鼠的粪便中，雄甾烷甾体、胆甾烷甾体、胆汁酸、醇及其衍生物、孕烷甾体、二十碳烯酸、脂肪酸酯、羟基甾体、亚麻酸及其衍生物显著下调。
大多数DEMs是二肽，它们可能无法通过KEGG分析，因此并未在图中显示。二肽应在蛋白质消化和吸收途径中的上调，表明氨基酸和二肽会随着粪便的排泄而丢失，这也是低蛋白血症的原因（图9）。
图9 | 粪便LC-MS代谢组学分析
8、血清质谱结果的一致性和准确性
LC-MS和GC-MS同时检测血清中的DEMs，其结果是一致的。LC-MS检测到TGs上调，GC-MS检测到胆固醇下调，LC-MS/MS检测到Alb下调与生化试验结果一致（表2）。DEPs中的Apoa1、Apoa2和Apoa4代表HDL，它们的下调与生化试验中HDL-C的结果一致。总共有25种免疫球蛋白或片段在DEPs、Jchain、Igkc和Ighg中被发现下调选择其为代表，生化试验结果与Glb一致。所有的比较都证明了MS检测结果的准确性。
表2 | 不同检测方法下DEM和DEP的一致性
相关讨论
研究发现血常规显示过量的甲状腺素导致了白细胞总数减少。流式细胞术检测出的甲状腺毒小鼠CD4/CD8比值和CD4+IFN-γ+T细胞数量减少，表明发生了免疫衰老。DIA蛋白质组学分析显示了免疫功能下降。脂毒性代谢产物的上调是免疫衰老的原因。
研究结论
文章通过LC-MS和GC-MS非靶代谢组学联合DIA蛋白质组学方法，检测甲状腺毒症小鼠的血清蛋白和脂质代谢物等，并从营养、代谢、免疫、内分泌角度分析甲状腺毒症与衰老疾病的关系。研究发现脂质代谢紊乱、营养不良、免疫衰老和脂毒性，是引发衰老相关疾病的机制。通过本研究不仅可用于衰老相关疾病的预防，也可用于新药的研发。
小鹿推荐
文章通过LC-MS、GC-MS非靶向代谢组学技术与DIA蛋白质组学技术，以甲状腺毒症模型为基础探究衰老疾病的机制，并为抗衰老药物的研发提供新思路。
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