前言
2022年7月12日，山东第一医科大学史伟云教授和高华教授团队于Cell Discovery（IF：38.079）在线发表了眼科疾病圆锥角膜单细胞测序的最新研究成果。作者对3例圆锥角膜患者中获取的中央角膜组织和4例健康对照者的中央角膜组织进行了10x Genomics高通量单细胞转录组测序，绘制了圆锥角膜的单细胞图谱，强调了角膜基质细胞在圆锥角膜形成中的关键作用，为深入理解圆锥角膜的发病机制提供了重要参考。
研究背景
圆锥角膜是在青少年中常见的角膜扩张性疾病，可导致进行性的视力下降甚至失明。角膜移植是治疗圆锥角膜最后可行的方案，但是给患者和社会带来了沉重的负担。尽管患病率很高，但其病因尚不完全清楚。
本研究对来自圆锥角膜患者和健康个体中央角膜的39214个细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-Seq）分析，以确定角膜中不同细胞类型在该疾病进展中的变化。本研究有助于理解圆锥角膜发病的分子机制，为圆锥角膜的预防和诊疗提供了新的见解。
期刊：Cell Discovery
影响因子：38.079
发表年月：2022年7月12日
材料：3例圆锥角膜患者中获取的中央角膜组织和4例健康对照者的中央角膜组织
方法：10x Genomics高通量单细胞转录组测序
研究结果
1. 圆锥角膜和健康角膜的细胞类型鉴定
为了全面了解患者的圆锥角膜和健康人正常角膜的细胞多样性和分子特征，研究从板层角膜移植术(DALK)后的圆锥角膜患者中获取3个中央角膜组织，从健康对照者中获取4个对照的中央角膜组织。将每个样本的组织分离，分别进行10X Genomics的scRNA-Seq(图1A)。所有圆锥角膜患者严重程度的评分均为5分。圆锥角膜表现为圆锥顶部突出和变薄、矢状曲率等病理生物学特征（图1B, 1C)。
经过严格质量控制步骤和去除双细胞，所有样本共获得39214个细胞，其中20312个细胞来自圆锥角膜，18902个细胞来自健康角膜，平均每个细胞有3339个基因和18247个转录本。所有样本的细胞被划分为6个细胞群（图1D），根据经典的特异性标记基因将6群细胞注释3种细胞类型，即角膜上皮细胞(CEC，表达KRT3、KRT12和KRT14)，角膜基质细胞(CSC，表达DCN、KERA和LUM)以及少量免疫细胞(ImC，表达CD45) (图1E, 1F)。
此外，研究分析了细胞类型特异性的生物学功能。三种细胞类型在圆锥角膜和健康角膜样本中的比例没有显著差异(图1I,1J)，表明在圆锥角膜的病理机制中，细胞的基因表达异常可能比细胞比例的改变更为重要。
图1 | scRNA-Seq分析人圆锥角膜和健康角膜的细胞组成
2. 圆锥角膜细胞类型特异性的转录信号改变
研究比较了圆锥角膜和健康角膜中每种细胞类型的转录特征。有340个上调基因和422个下调基因在至少一种细胞类型中被检测到，大多数差异基因表现为细胞类型特异性的特征(图2A)。角膜基质细胞上调的基因参与胶原代谢过程和细胞外基质降解，符合圆锥角膜降解和基质变薄的临床表现；角膜上皮细胞上调的基因参与“角质化”和“上皮细胞分化”等过程；免疫细胞上调的基因参与免疫相关过程，如白细胞迁移和炎症反应(图2B)。作者从OMIM Clinical Synopsis (https://www.omim.org)下载了136个圆锥角膜相关基因，结合scRNA-Seq鉴定的细胞类型，绘制了细胞类型特异性的圆锥相关基因的表达谱，且发现角膜基质细胞中富集的圆锥相关基因比例最高(图2C)。
接下来，作者比较了已知的圆锥角膜相关基因（胶原家族成员、细胞外基质和基质金属蛋白酶相关基因）在不同细胞类型中特异性的表达模式。几乎所有胶原基因在基质细胞中均表达丰富，COL5A1、COL5A3等基因在圆锥角膜组下调，解释了圆锥角膜疾病中胶原纤维减少的原因；细胞外基质基因在圆锥角膜组的基质细胞中广泛下调；基质金属蛋白酶相关基因在圆锥角膜组的基质细胞中上调(图2D)。有趣的是，作者发现胶原家族成员、细胞外基质和基质金属蛋白酶相关基因并不局限于基质细胞，某些基因在其他细胞类型中差异表达，表明所有类型的角膜细胞均可能在圆锥角膜的细胞外基质失调中发挥重要作用。
为了评估转录因子(TF)在圆锥角膜和健康角膜中的表达状态，作者进行了单细胞SCENIC分析，鉴定到圆锥角膜基质细胞中NFKB1、EGR1、BCLAF1、CEBPD和XBP1等5个转录因子减少(图2E)，其中一些与细胞外基质相关的靶基因FN1、COL12A1、TIMP3和FBLN5等在圆锥角膜中也表达下调(图2F)。作者进一步证实，这些转录因子的预测靶基因在细胞外基质、胶原合成和细胞凋亡等功能显著富集(图2G)。总之，作者确定了特定细胞类型中候选转录因子的异常表达，并揭示了它们在圆锥角膜进展中可能发挥的调节作用。
图2 | 圆锥角膜每种细胞类型中转录谱和调控网络的变化
3. 机械力与圆锥角膜基质细胞的转录变化
作者从圆锥角膜和健康角膜基质细胞的差异基因(图2A)中，选择了top基因进行进一步研究(图3A)。圆锥角膜的基质细胞上调的基因包括MMP1和MMP3(图3B)，它们能够降解纤维性角膜胶原，并在圆锥角膜基质变少中发挥作用。作者鉴定了两种新的潜在的圆锥角膜相关酶基因CTSD和CTSK，免疫组化分析证实圆锥角膜基质细胞中CTSD和CTSK蛋白水平升高(图3C)，为圆锥角膜的诊断和治疗提供了新的生物标志和潜在靶点。
“揉眼”在临床上被认为是圆锥角膜患病的风险因素之一，但机械力如何影响圆锥角膜的发病、以及机械力和圆锥角膜基质降解之间的关系并不明确。作者发现两个核心的力学转导因子YAP1和TEAD1在圆锥角膜基质细胞中均升高，意味着圆锥角膜中的基质细胞对机械力的响应(图3D)。进一步通过对角膜基质细胞系进行机械力牵张实验，发现对细胞加力之后，角膜基质细胞内包括MMP1、MMP3、CTSD以及CTSK在内的蛋白酶表达显著上调（图3E-3G），提示角膜基质细胞对机械力是有响应的，且施加机械力会促进多种蛋白酶的表达，从生物力-蛋白酶作用轴的角度解释了“揉眼通过力学信号促进蛋白酶分泌机制加剧圆锥角膜发展”的临床现象，同时也为临床预防圆锥角膜进展提供了重要的理论基础。
接下来，作者研究了圆锥角膜基质细胞的异质性，将基质细胞分为5个亚群C0-C4（图3H)，圆锥角膜和健康角膜样本中亚群分布类似。功能富集显示细胞外基质相关的生物学过程在C0和C2中富集，对缺氧的反应项在C1中富集，对未折叠蛋白的反应在C3和C4中富集，表明基质细胞功能或状态存在异质性（图3I）。作者评估了本研究鉴定的圆锥角膜相关基因在不同基质亚型中的特异性表达，发现这些基因在C0-C2细胞中富集（图3I，3J）。
图3 | 圆锥角膜和健康角膜中角膜基质细胞的转录改变和异质性分析
4. 圆锥角膜样本中分化异常的角膜表层上皮细胞
为了深入分析圆锥角膜上皮细胞以及转录变化，作者对这些细胞进行了无监督的重聚类，圆锥角膜上皮细胞被分为角膜基底细胞(CBCs，表达GJA1)，角膜上皮层基底细胞(CSbCs，表达KRT3)和角膜浅表细胞（CSfCs，表达IVL和LYPD2）（图4A，4B）。根据角膜上皮细胞上调的基因参与“角质化”和“上皮细胞分化”等功能（图2B），作者对三种与角质细胞分化相关基因的进行了评分，所有圆锥角膜上皮细胞亚型的得分均显著较高，尤其角膜表层上皮细胞(图4C)。
然后作者分析了角质化和分化相关基因细胞类型特异性的表达模式，发现这两组基因在圆锥角膜样本中富集，尤其是角膜浅表细胞。从其中鉴定出一种在角膜浅表细胞高度特异表达的基因KRT80，与晚期组织或细胞分化有关（图4D）。免疫组化染色证实圆锥角膜角膜浅层存在的KRT80信号（图4E）。角膜浅表细胞另一个显著增加的基因SPRR1B 是鳞状化生的生物标志（图4F）。这些数据显示圆锥角膜患者浅表细胞分化活跃，角化和鳞状化生信号增加。
图4 | 圆锥角膜上皮转录变化的异质性
5. 免疫细胞在圆锥角膜病变中的作用
圆锥角膜是否具有炎症特性一直存在争议。作者将免疫细胞重新进行无监督聚类后，在圆锥角膜和健康角膜中鉴定出巨噬细胞/单核细胞、树突状细胞和T细胞(图5A)，但没有发现免疫细胞比例在组间的变化（图5B）。圆锥角膜中巨噬细胞/单核细胞上调的基因富集炎症反应和细胞外基质分解;在树突状细胞中富集对细胞因子的反应;而T细胞富集于T细胞受体信号通路和ATP生物合成过程(图5C)。多种白细胞介素(如IL23A)和趋化因子(如CXCL1)在圆锥角膜的树突状细胞中显著升高，表明在圆锥角膜发病过程中免疫反应被激活(图5D)。该部分为圆锥角膜的炎症特性的提供了证据。
图5 | 免疫细胞贡献圆锥角膜中的炎症信号
6. 圆锥角膜细胞间通讯异常
圆锥角膜具有异常的生物力学特性，作者分析了YAP信号通路中基因的表达，观察到在角膜上皮细胞和角膜基质细胞中均多个基因下调，并鉴定了关键基因YAP1在角膜上皮细胞和角膜基质细胞亚型中表达水平（图6A，6B）。
图6 | 细胞间通讯信号中与圆锥角膜相关的变化
作者进行了细胞-细胞相互作用分析(CellPhoneDB)，发现圆锥角膜中只有很少的相互作用，大部分细胞间相互作用消失，尤其是角膜上皮细胞和角膜基质细胞之间以及角膜上皮细胞自分泌信号。考虑到基质是圆锥角膜进展过程中发生变薄和胶原降解的主要部位，作者重点研究了与角膜基质细胞有关的细胞间作用，发现细胞间信号的下调（图6C）。角膜上皮细胞和角膜基质细胞之间消失的相互作用，如FGFR2-XPR1, FGFR2-CD83等与成纤维细胞生长因子信号通路相关(图6D)。免疫细胞与角膜基质细胞之间消失的相互作用，如IL1RN-IL1受体抑制剂、IL1RN-IL1受体与抗炎反应有关 (图6E)。
此外，NicheNet预测免疫细胞衍生的IL24可能会诱导圆锥角膜的角膜基质细胞中MMP1的差异表达。MMP2在角膜基质细胞中的表达与免疫细胞衍生的APOE和MMP9相关。MMP3与免疫细胞衍生的MMP9和角膜上皮细胞衍生的LGALS3相关。重要的是，金属肽酶抑制剂基因TIMP2与免疫细胞衍生的APOE和POMC相关（图6F）。这些结果表明，在圆锥角膜进展过程中，MMPs和TIMPs的平衡是角膜基质中细胞外基质完整性和功能的关键决定因素，可能受角膜基质细胞和免疫细胞/角膜上皮细胞之间的通讯调节。
文章总结
作者系统地研究了圆锥角膜和健康角膜样本之间的细胞类型特异性转录组，证实了角膜基质细胞在该疾病中的关键作用。研究证明了角膜基质细胞的细胞外基质降解在该疾病中的重要作用，揭示了“机械力—力学信号—蛋白酶”作用轴在促进圆锥角膜进展中的重要作用，为“揉眼可加剧圆锥角膜”的临床现象提供了解释。此外，角膜上皮病变、免疫细胞中炎症信号的增强以及细胞间通讯失调也参与了圆锥角膜的形成（图7）。以上发现为圆锥角膜基础研究、深入理解圆锥角膜等扩张性疾病的发病机制提供了重要的数据资源和理论参考，更为该疾病的预防和诊疗提供了理论依据。
图7 | 肿瘤和免疫细胞之间基于配体受体的细胞间通讯
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