研究·背景
硬组织的优异机械性能归因于⽣物矿化，这主要是由特定功能的必要性驱动的，例如⽀持或保护。与拥有⻣内⻣骼的脊椎动物相反，甲壳类动物具有稳定和保护⾝体作用的是外⻣骼。
外⻣骼是⼀种纳⽶复合材料，主要由嵌⼊有机基质⽹络中的 CaCO3 矿物质组成，有机基质⽹络由排列成扭曲胶合板结构的 α-⼏丁质-蛋⽩质纤维形。
⻆质层硬化是通过硬化和钙化实现的。前者是指被蛋⽩质覆盖的⼏丁质纤维之间形成交联，是所有节肢动物的主要硬化机制。后者发⽣在⼤多数地壳中，其中的组成、对称性、⼤⼩和形状发⽣变化。
CaCO3微晶可以控制⽆脊椎动物外⻣骼部分的机械性能，如颚、⽖和甲壳。由于这些原因以及甲壳类动物钙化结构的周期性合成和再吸收，它们被⼴泛研究并被视为⽣物矿化研究的模型。
在⽔⽣⽣物中，CaCO3通常以三种结晶多晶型物存在：⽅解⽯、⽂⽯和球霰⽯(Lowenstam, 1981)。然⽽，还在⼏种不同的物种中检测到⽆定形碳酸钙 (ACC) （Aizenberg 等⼈，1996 年；Beniash 等⼈，1997 年；Hasse 等⼈，2000 年；Levi-Kalisman 等⼈，2002 年；Mergelsberg 等⼈等⼈，2019 年；Weiss 等⼈，2002 年）。
⽣物活性炭通常含有⼤量的镁和磷酸盐（Weiner 等⼈，2003 年）。它的⽆定形特征是从 X 射线衍射 (XRD) 图案中没有明确定义的峰和拉曼光谱的低频部分中离散的 CaCO3 晶格模式推断出来的（Wehrmeister 等⼈，2011）。有⼈提出 ACC 是结晶相的前体。
在许多情况下，无定形钙碳酸钙与 CaCO3晶相共存（Aizenberg 等⼈，1996 年；Beniash 等⼈，1997 年；Mergelsberg 等⼈，2019 年；Wehrmeister 等⼈，2011 年；Weiss 等⼈，2002 年）。
此外，已检测到具有不同短程有序的各种 ACC 相，这被称为多晶现象，类似于在结晶 CaCO3 中观察到的多晶现象（Cartwright 等⼈，2012 年）。
在海胆⻣针中，已鉴定出两种⽆定形矿物相以及⽅解⽯结晶相（Gong 等⼈，2012 年；Politi 等⼈，2008 年）：1 型 ACC，它是 ACC 的⽔合形式 (ACC H2O )和 2 型是⽆ ⽔的。在这类⽣物材料中提出了ACC H2O → ACC → ⽅解⽯转化。
研究 · 内容
在这项研究中，我们应⽤拉曼光谱和近边 X 射线吸收精细结构 (NEXAFS) 光谱以及透射电⼦显微镜 (TEM) 来研究 Calappa granulata 外⻣骼中存在的碳酸钙相。
这种螃蟹的表⽪呈现出特有的橙红⾊，带有暗红⾊斑点。甲壳类动物的体⾊是⼀种视觉线索，在交流、互动、性⾏为和竞争 ⾏为中起着重要作⽤（Baldwin 和 Johnsen，2009）。
甲壳类动物（例如螃蟹和⻰虾）的橙⾊归因于虾⻘素 (AXT)，它是⼀种类胡萝⼘素发⾊团（ Buchwald 和 Jencks，1968 年；Cianci 等⼈，2002 年；Salares 等⼈，1977a；Tilley，2011 年）。
AXT 在甲壳类动物的外⻣骼中的存在可以通过拉曼光谱轻松识别，因为它在⼤约 1500、1150 和 1000 cm−1处提供强条带（Rivera 和 Canela-Garayoa，2012）。
拉曼光谱作为⼀种⾮破坏性技术，也已被⽤于明确区分 CaCO3 的结晶相和⾮结晶相以及检测磷酸盐 − CO3的ν1拉伸模式的位置、分裂和半峰全宽 (FWHM) 。1080 cm−1是 CaCO3 ⾮晶态或晶态的安全指纹。
另⼀⽅⾯，出现在拉曼光谱低频部分的晶格模式可以安全地⽤于鉴定晶体 CaCO3多型体，因为它们主要受晶体对称性的影响。
NEXAFS 光谱学也应⽤于钙化组织的研究。它是元素特定的，探测空电⼦态的部分密度，提供有关局部键合配置和对称性的信息。
更具体地说，在 CK 吸收边缘记录的 NEXAFS 光谱探测电⼦从 C 1s 初始状态到具有 p 组件的最终状态的跃迁，这对碳的键合配置敏感 。
在 Ca L3,2-边缘 NEXAFS 光谱中，主要跃迁是2p3/2,1/2 → 3d。由于晶体场对 d 电⼦态的修改，NEXAFS 光谱对 Ca 的局部键合⾮常敏感。
⽣物矿物微晶的直接观察（形状、⼤⼩、取向）可以通过 TEM 实现，⽽选区电⼦衍射 (SAED) ⽤于鉴定纳⽶晶体的晶体结构。
研究 · 结果
*01
雄性 Calappa granulata 蟹是从当地海鲜供应商处获得的。它采集于北爱琴海，处于蜕⽪间期。从内部去除软组织后，⽤⽔清洗外⻣骼，晾⼲并存放在空⽓中。所研究的螃蟹的照⽚如图1所⽰。
拉曼光谱是从蟹外⻣骼的选定点记录的（甲壳：C1-C3、M1、R1；⼿掌：RP1-RP4；腕⻣：RC1；⼿指：RF1、RF2；腿：RL1、RL2），如图所⽰。
拉曼光谱还从属于外⻣骼部分的点记录了从那⾥获得 NEXAFS 光谱（图1 中的点 1-15）。对于 NEXAFS 测量，外⻣骼的各个部分被切割并压碎以制备细粉，将其压在有划痕的 In 箔上以消除充电效应。
结晶⽅解⽯样品⽤作参考。NEXAFS 光谱是在超⾼真空条件下 (~5 × 10−10 Torr) 记录的，使⽤BESSY-II 存储环的俄罗斯-德国光束线上的 C K- 和 Ca L3,2- 吸收边缘处的光电流信号Helmholtz Zentrum Berlin 的设施。
它们通过位于样品前⾯的具有⾼透射率的⾦⽹格的信号进⾏归⼀化，以考虑单⾊仪的传输函数。
图1
Fig. 1. Photograph of the studied Calappa granulata crab and parts of the exoskeleton. Spectra were recorded from points 1–15 (NEXAFS, Raman) and 1–15, RPi, RFi, RC1, M1, R1, Ci, RLi (Raman).
使⽤配备三重单⾊仪和帕尔贴冷却光电倍增管的 RAMALOG-5 系统以反向散射⼏何结构记录拉曼光谱。对于激发，使⽤了 Ar+ 离⼦激光 (λ = 488 nm) 的蓝线，光谱分辨率为 ca。2厘⽶-1 。
使⽤ f = 10 cm 的球⾯透镜聚焦光束，样品上的光斑直径约为 1 mm。使⽤ Ar+激光等离⼦线校正单⾊器偏移。TEM 图像是从 pos 记录的。5（甲壳）如图1 所⽰，使⽤ 100 kV JEOL 100CX 显微镜。通过划痕制备样品。
*02
从甲壳顶部（位置 5）的横截⾯记录的光学显微镜图像如图2（a）所⽰。亮 (BF) 和暗场 (DF) TEM 图像以及 SAED 图案如图2 (b,C）。
光学显微镜图像[图 2(a)] 揭⽰了⼀种层状结构，这是内表⽪的特征，⽆法在外表⽪中解决，很可能是由于更密集的堆叠（Chen 等⼈，2008）。
外⻆质层被向远端⽅向凸出的内⻆质层部分中断 [图2(a)中标有“B” ]。未受⼲扰的外表⽪区域标有“A”。
图2
Fig. 2. Optical and electron microscopy images of part of the carapace. (a) Cross section optical microscopy image which shows the regions of endo-, exo- and epi-cuticle. Bright (BF), dark (DF) field TEM images and corresponding Selected Area Electron Diffraction (SAED) patterns recorded from regions A and B, are shown in (b) and (c) on the left, right and middle panel, respectively
从 A 和 B 区域记录的 BF、DF 图像和 SAED 图案分别显⽰在图2（b）和（c）的左、右和中⾯板中。区域 A 的 BF 和 DF 图像显⽰存在平均尺⼨为 20 nm 的微晶，验证了⽆机成分的纳⽶晶体特征。
在区域 B 中，层状结构在纳⽶级也很突出。A 区和 B 区的 SAED 图案都是⽅解⽯的特征。
然⽽，在区域 A 中，纳⽶微晶出现随机取向，因为它是从 SAED 图案中观察到的环推断的，⽽在区域 B 中，它们表现出优先或定位。
*03
⻣骼的不同部分记录的代表性 C K-edge NEXAFS 光谱如图3（a）所⽰。由 C 1s → 2π* 跃迁引 起的峰在 285‒292 eV 的能量范围内很突出，它们的位置由垂直线表⽰。这些峰是根据Benzerara 等 ⼈采⽤的符号名的。
更具体地说，特征 a*、k*、p*、cx*、cn* 分别出现在 285.2、286.8、288.2、288.5 和 290.3 eV，分别对应 于芳⾹族、酮/酚、酰胺羰基（肽）、羧基和碳酸盐物种，分别。
由于蛋⽩质和/或⼏丁质聚合物中 C]O 键的转变，p* 和 cx* 峰下的⾯积 Ap*, cx *可以被认为与外⻣骼的有机成分成正⽐，⽽⾯积在 cn* 峰 下， Acn与（碳酸钙）⽆机成分成正⽐。
因此，钙化率可以定义为：碳酸盐 = Acn*/(AAcn*** + pcx)
并且可以作为碳酸钙含量的相对量度,在外⻣骼的各个部分。
为了确定峰下的⾯积，使⽤ S 形函数和⾼斯函数拟合光谱，以分别考虑从 1s 初始状态到连续体 中具有 p 分量的最终状态和最终束缚态的转变（Lam 等⼈，2016 年） 。
图3
Fig. 3. C K-edge NEXAFS spectra and calcification map. (a) Representative C Kedge NEXAFS spectra recorded from ventral (pos.1) and dorsal (pos.2) part of the exoskeleton. Vertical lines indicate the position of the 1s → π* transitions denoted according to Benzerara et al. (2004). A representative fitting is shown for the spectrum recorded from pos. 1 using a step function and a number of Gaussians that simulate the transitions to the continuum and to bound states, respectively. (b) Color map of the calcification ratio, Rcarbonate. The Rcarbonate values are also shown on the map.
代表性的配件如图3（a）所⽰。所检查外⻣骼区域Rcarbonate值列于表1。
外⻣骼的粗略Rcarbonate颜⾊图如图3（b）所⽰。红⾊区域对应于更⼴泛的钙化，⽽蓝⾊区域对应于 CaCO3含量较低的区域。
应该指出的是， Rcarbonate并没有提供参与碳酸钙形成的 C 的确切百分⽐，⽽是与该百分⽐成正⽐，因为对于所有考虑的 1s → π*，跃迁概率不⼀定相同过渡。该图显⽰⽖末端的钙化率较 ⾼，⽽腿尖的钙化率较低。在甲壳上也观察到变异。
*04
L3,2-edge NEXAFS 光谱由 Ca 原⼦的 2p → 3d 跃迁主导。⾃旋轨道相互作⽤导致两个主要吸收特征被 ca 分开。
3.3 eV（⾃旋轨道分裂）对应于2p3/2 (L3)或2p1/2 (L2)初始状态。晶体场 (CF) 相互作⽤会导致每个 L 边主峰进⼀步分裂，导致在每个主峰的低能量区域出现强峰或肩峰。
参考结晶⽅解⽯样品的Ca L3,2-边光谱如图4所⽰。峰值符号根据Fleet 和 Liu (2009)。Ca L3,2-edge 光谱可以利⽤原⼦多重计算来模拟，以考虑 2p-3d 和 3d-3d库仑和交换相互作⽤、2p 和 3d ⾃旋轨道相互作⽤以及作⽤于 3d 状态的晶体场（de Groot 等⼈，1990）。
在⽅解⽯（空间群 R-3m）中， Ca2+的位点对称性为3¯ ，并且与属于平⾯离⼦的 O 原⼦配位 6 倍（⼋⾯体）。在⽂⽯（空间群 Pmcn）中， Ca2+具有位点对称性- CO3 m，与 ⼀步 O 原⼦配位 9 倍。
与⽅解⽯相⽐，⽂⽯中 Ca 的较⼤多⾯体导致晶体场较弱，这进反映在强度以及 a1 和 b1 峰分别与主a2和b2峰的分离中（Fleet 和 Liu , 2009)。
图4
Fig. 4. Fitting and simulation of the Ca L3,2-edge NEXAFS spectrum of a crystalline calcite sample. The experimental spectrum is shown in blue dotted line whereas the simulation and the fitting curves in thick solid lines. Voigt functions were used for the fitting while for the simulation, the CTM4XAS software was employed. The peaks marked with asterisks were necessary to improve the fitting quality and can be substantiated by the simulation. Vertical red lines indicate the positions and the relative intensities of the lines predicted by the CTM4XAS multiplet calculations. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
更具体地说，能量差a2-a1 （L3分裂）和对于⽅解⽯和⽂⽯， b2-b1 （L2分裂）分别为 1.3 和 0.8。b2 -a2 （⾃旋轨道分裂）没有受到显着影响，⽅解⽯和⽂⽯的值分别为 3.4 和 3.3。最后，1 峰和 2 峰也向⽂⽯的主峰移动。
ACC·H2O 和 ACC 相的Ca L3,2-edge 光谱的特点是a1和b1峰的强度低于结晶⽅解⽯对应物，⽽ a2在脱⽔的 ACC 相中强度更⾼。
然⽽，最近⼀项关于⽔合 ACC 相变过程的研究表明，2 型 ACC 相不是 1 型 ACC 的⽆⽔相，⽽是在纳⽶颗粒中发现的⽆序碳酸钙相，具有纳⽶级的⽅解⽯结构。结晶⽅解⽯的光谱使⽤ Voigt 函数进⾏拟合，如图4所⽰。
除了预期的峰 1、2、a1 、a2、 b1、 b2 （Fleet 和 Liu，2009），另外三个峰，⽤a 标记作为 terisks，有必要考虑主峰的不对称性，这由于光束线的良好光谱分辨率⽽变得明显。
如果使⽤ D4h 对称性（10Dq = 1.10 eV，Ds = -0.07 eV，Dt = 0）⽽不是使⽤D4h对称性（10Dq = 1.10 eV，Ds = -0.07 eV，Dt = 0）⽽不是使⽤ CTM4XAS 代码进⾏多重计算（Stavitski 和 de Groot，2010） Oh对称性解释了 Ca 周围未扭曲的⼋⾯体。
*05
尽管⽅解⽯⼋⾯体中的 Ca-O 距离相等，但 O-Ca-O ⻆略微偏离 90° （Rez 和 Blackwell，2011）。图 4中所⽰的模拟对应于 0.1 的洛伦兹和⾼斯展宽。
从外⻣骼的不同位置记录的代表性 NEXAFS 光谱如图5所⽰。光谱经过能量转移，使b2 峰与相应的⽅解⽯峰重合。他们还进⾏了双步（S 形函数）减法（ L2、 L3边各⼀个）。
图5
Fig. 5. Ca L3,2-edge NEXAFS spectra recorded from various parts of the exoskeleton. The spectra recorded from the exoskeleton are plotted with thick black lines and are compared with the spectrum of a calcite reference sample which is plotted with thin red lines. Smaller peak separations (a2-a1 and b2-b1) due to CF splitting are observed in the spectra from regions with high amorphous content (pos. 5) compared to well crystallized regions (pos. 7) that exhibit higher splitting that is closer to the splitting in reference calcite sample. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
为了便于⽐较，⽅解⽯参考样品的光谱（以红线显⽰）也 包含在图5 中。
从⽖指（位置 7）记录的光谱与结晶⽅解⽯的光谱⾮常匹配，⽽从其他位置（5、 10、12）在L2、 L3 CF 分裂（a2-a1和b2-b1分离）中表现出强烈的偏差。
*06
为了确定峰值位置，使⽤ Voigt 函数（30% 洛伦兹 - 70% ⾼斯分布）拟合光谱。a2 -a1和 b2-b1峰分离与⾃旋轨道分裂⼀起列于表 1中。
图 6 （下图）绘制了 L3 与 L2 分裂以及结晶 ⽅解⽯、⽂⽯（Fleet 和 Liu，2009 年）、纳⽶晶⽅解⽯（Tsao 等⼈，2019 年）和 ACC （Gong 等⼈）的相应分裂等⼈，2012 年；Albéric 等⼈，2019 年）。
图的上⾯板显⽰了范围 从 0.7 到 1.4 eV的L2分裂值的数据扩展视图。在外⻣骼的不同部分之间检测到变化。
观察到 的值介于晶体和纳⽶晶体或⽆定形⽅解⽯的相应值之间。在⽖的⼿指（位置 7）中观察到较 ⼤的L2和L3分裂值，⽽在甲壳顶部（位置 5）测量到较低的值。
整个外⻣骼中L2和L3分裂值的变化可归因于微晶尺⼨和/或⽆定形相对于结晶碳酸钙含量的变化。
图6
Fig. 6. L3 vs. L2 crystal field splitting of the Ca L3,2-edge spectra. (bottom panel) L3 vs. L2 crystal field splitting of the spectra recorded from various parts of the exoskeleton (filled circles). Open red square, blue star, green up triangle, yellow down triangle and magenta rhomb correspond to the calcite reference sample, nanocalcite (Tsao et al., 2019), aragonite (Fleet and Liu, 2009), and ACC (Albéric et al., 2019; Gong et al., 2012), respectively. The y = x line is plotted in solid line. The part of the graph that corresponds to the crab data is magnified in the top panel where the numbers corresponding to various positions of the crab exoskeleton are shown in Fig. 1. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
从外⻣骼的有⾊部分记录的代表性拉曼光谱如图7所⽰。检测到由 CaCO3和虾⻘素 (AXT) 发⾊团引起的峰。源⾃ AXT 发⾊团的峰出现在 960(w)、1007(m)、1156(s)、1193(m)、 1273(w)、1320(w) 和 1518(s) cm−1。
位于 1518 cm−1处的最强峰被分配给 C]C 键拉伸模式。它的频率值取决于⼏个参数，例如类胡萝⼘ 素分⼦的多烯链的共轭度和⻓度、极性溶剂引起的极化和链的平⾯度。
在 1156 cm-1处的第⼆个最强峰具有来⾃多烯链 的 C-C 拉伸模式和⾯内 C-H 弯曲模式的贡献。⼤约 1005 cm−1处的峰值对应于 CH3摇摆 振动。
来⾃ CaCO3 的最强峰v1出现在 1087 cm−1处，这是− CO3离⼦振动的特征。这个 峰的位置不能安全地⽤于⽅解⽯或⽂⽯多型的鉴定，因为这种模式可以使两种多型中存在 的离⼦振动（Nehrke 等⼈，2012） 。
*07
然⽽，由于两种多型体的晶体结构不同（⻅3.2.2 节 的讨论），出现在光谱低频部分的晶格模式可被视为多型体结构的指纹。
在所研究的样品点 中，发光没有掩盖拉曼信号，检测到以 280 cm-1为中⼼的宽（FWHM 约为 30 cm-1 ）低强 度峰，证实 CaCO3采⽤⽅解⽯结构（ Behrens et al., 1995)根据 NEXAFS 和 TEM 结果。
图 7的插图显⽰了在v1( -CO3 ) 峰附近的频率范围内从外⻣骼的不同部分记录的光谱。还包括结晶⽅解⽯的相应峰。从螃蟹记录的光谱中v1( − CO3 ) 峰的宽宽度表明 CaCO3形 成纳⽶晶体甚⾄⾮晶相。
在某些样本点中， ν1( − CO3 ) 峰表现出明显的不对称性，以防⽌ 波数较低。为了解释这种不对称性，按照 Wehrmeister 等⼈提出的程序对峰值进⾏了拟合。
图7
Fig. 7. Raman spectrum recorded from a pigmented part of the exoskeleton. The inset shows spectra around the most intense peak of CaCO3, v1 ( − CO3 2 ), acquired from three different parts of the claw, along with that of calcite.
即使⽤了两个贡献，⼀个洛伦兹线形 (L)，在⼤约 1088 cm-1对应于（纳⽶）结晶 CaCO3和⼀个⾼斯线形 (G)，位于⼤约 1078 cm-1对应于 ACC 相. Wehrmeister 等⼈。(2011)应⽤此模型来拟合从双壳类、淡⽔养殖珍珠和潮⾍样本记录的光谱中的ν1( − CO3 ) 峰。
在 Calli nectes Sapidus 蟹⽖的⼿掌中也检测到CO3 离⼦的ν1峰的两个贡献 (Katsikini, 2016)。拟合结果列于表2。在 C. granulata 甲壳的⼤部分斑点中检测到两个 CaCO3 相。
被称为结晶的相相当纳⽶晶，因为它可以从相应拉曼峰的 FWHM 推断出来，该峰 ⽐结晶⽅解⽯参考样品 (3.6 cm-1) 的 FWHM ⼤ 2.4-4.2倍。
由于指定峰的更宽轮廓 （FWHM 范围为 9 ⾄ 23 cm−1 ）和/或其向较低频率的偏移，第⼆相被称为⾮晶相。
模式软化和较⼤的 FWHM 是由结构紊乱引起的，结构紊乱会导致选择规则的松弛或破坏，从⽽ 实现较⼤的波⽮量值的贡献，这反过来⼜对应于较低的振动频率值。
将对应于纳⽶晶相和⾮晶相的峰下⾯积的⽐率定义为可 ⽤于量化两相的结晶度指数。但是，在⽆定形贡献为零的情况下⽆法定义该指数。为了减轻这 种不确定性，这⾥我们将结晶⽐定义为纳⽶晶组分相对于总碳酸钙含量的⽐值：
其中， Anc和Aam分别是对应于纳⽶晶相和⾮晶相的峰下⾯积。表2列出了不同外⻣骼部位 获得的 Rcry 值。可以推断，在⽖指和⼿掌的斑点中发⽣了 100% 的结晶。
在较软的外⻣骼部 分（例如甲壳的顶部），存在⼤量的⽆定形相。此外，观察到洛伦兹峰宽度的变化，这意味着⽅解⽯微晶尺⼨在外⻣骼的不同部位也不同。在位于⼿指和⼿掌的斑点中观察到与较⼤微晶尺⼨相 关的较⼩宽度 (RF2, RP1)。
*08
为了提供⼀种量化ACC的⼿段使⽤ Ca L3,2-edge NEXAFS 光谱的含量，我们绘制了⽤拉曼光谱获得的结晶⽐与从 Ca L3,2- edge NEXAFS 光谱分裂的L2晶场（图8a）。
出于这个原因，拉曼光谱也从外⻣骼⽚的中⼼点 记录下来，NEXAFS 光谱也从那⾥记录下来。为了完整起⻅，我们提到由于强烈的发光诱导背 景，尝试直接从⽤于测量 NEXAFS 光谱的粉末样品测量拉曼光谱是不成功的。
⼀般来说，与⻆ 质层的染⾊部分相⽐，⽩⾊区域产⽣的背景要⾼得多。获得的⽅程 Y = - 3.01 + 3.28 X（R = 0.902）可⽤于根据 NEXAFS 光谱（X：L2 分裂）的特征确定结晶率 (Y ) 。
图8
Fig. 8. Crystallizaton ratio dependence on the L2 splitting. (a) Dependence of the crystallization ratio, Rcry, on the L2 splitting as determined by Raman and Ca L3,2-edge NEXAFS spectra, respectively. Blue circles correspond to spectra recorded from various positions of the exoskeleton (see Fig. 1). The red curve corresponds to linear fitting (Y = -3.01 + 3.28⋅X), exhibiting a high degree of correlation. (b) Color map of the crystallization ratio as determined by the L2 splitting and the polynomial fitting curve. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
图8（b）中包含⼀张粗 略显⽰外⻣骼各部分结晶率的彩⾊图。在⽖指处确定了较⾼的结晶⽐率，⽽较低的值对应于腿 和甲壳的顶部。
应该指出的是，Ca L3,2-edge NEXAFS 光谱提供了来⾃特定外⻣骼部分的平均 信息，因为实验只能在粉末样品上进⾏。
C K-edge NEXAFS 光谱可直接测量各种样品中CaCO3 的相对量外⻣骼的⼀部分。在⽖的末端（⼿掌和⼿指）发现了较⾼的 CaCO3含量，⽽在腿中检测到较低 的含量，尤其是它们的尖端。在外⻣骼的腹侧部分（位置 1）显⽰出相对较⾼的钙化率，⽽在甲壳 中观察到相当⼤的变化。
C. granulata 中的CaCO3不采⽤在 C. sapidus 中检测到的⽂⽯结构，因为拉曼光谱中没有⽂⽯晶格模式以及 Ca 的晶场分裂清楚地证 实了这⼀点NEXAFS 光谱中的L2和L3 边缘峰。通过 TEM 和相应的 SAED 图案检测到甲壳⻆ 质层上⽅解⽯微晶的形成，平均尺⼨为 20 nm。
后者揭⽰了外⻆质层部分微晶的随机或优先取 向，以及分别源⾃内⻆质层和穿透外⻆质层的凸起。⽂⽯的不存在表明 C. Granulata 不会通 过采⽤不同结晶多型体的合成途径来改变外⻣骼的机械性能。
拉曼光谱被证明对⾮晶相的存在⾮常敏感。在⼿掌 (RP1、RP2、RP4) 和可移动⼿指的⽛⻮ (RF2) 的斑点中发现 ACC 相不存在，⽽在甲壳的三个斑点 (C1-C3) 中检测到低结晶率。此外，Ca L3,2- edge NEXAFS 光谱也被 证明对 CaCO3 的晶态或⾮晶态敏感。
在后⼀种情况下，晶体场强减弱，导致主要L2和L3峰之 间的分离减少，同时出现在其低能侧的峰强度降低。从外⻣骼的不同部位记录的 Ca L3,2-edge NEXAFS 光谱与结晶⽅解⽯光谱的直接⽐较清楚地表明与从可移动⼿指记录的光谱⾮常相似 （就强度和分离度⽽⾔）晶场分裂峰有关）。
从外⻣骼的其他部分记录的光谱产⽣了更明显的 差异。通过L2分裂拉曼获得的结晶率图产⽣了以下形式的线性相关性：（结晶率）= −3.01 + 3.28
并可⽤于根据 NEXAFS 光谱的特征确定结晶率。在⽖指处鉴定出较⾼的结晶率，在腿部和甲壳 顶部鉴定出较低的值。
找到类似于⽆序框架材料的代表性结构，其中有富含⽔的通 道，分离⽆定形碳酸钙的区域，含⽔量降低。
根据我们的模型，如果具有较⼲核和较湿壳的纳⽶粒⼦在⽣⻓的第⼆阶段团聚，就会出现这种结构， 正如 Pouget 等⼈所提出的那样，但⽔扩散速度很慢，因此均匀分布⽆法达到。
NEXAFS 和拉曼光谱都揭⽰了此处研究的粒状蠊外⻣骼中CaCO3 的钙化和结晶存在显 着变化。迪拉曼等。(2007)研究了蓝蟹 (C. sapidus) 的钙化过程，发现碳酸钙⾸先沉积为 ACC，然后转变为结晶相。
另⼀⽅⾯，在美国⻰虾 (Homarus amer icanus) 的⻆质层中，仅在外⻆质层的外部检测到结晶 CaCO3，⽽ ACC 在外⻆质层和内⻆质层的内部普遍存在(AlSawalmih 等, 2009)。
对陆⽣甲壳类动物 Porcellio scaber、Armadillidium vulgare 和 Tyloseuropaeus Arcangeli 也进⾏了类似的观察。然⽽，ACC 也被发现在等⾜类动物中发挥结构作⽤，结晶碳酸钙CCC和 无定形钙ACC 的数量随深度变化，从⽽优化外⻣骼对抗捕⻝者的机械性能。
C. granulata 外⻣骼各部分钙化和结晶⽐例的检测变化可能与各部分的不同功能有关。为了 抓住和压碎⻝物，⽖的末端应该更硬，⽽腿应该更灵活，因此更柔软。
ACC 的存在与⾼浓度有 机材料相结合，在⻆质层中的优势是柔韧性、可塑性和强度和韧性的优化，⽽更多的结晶⽅解⽯ 赋予硬度（Al-Sawalmih 等⼈，2009 年；Neues等⼈，2007 年）。
绵⽺蟹 (Loxorhynchus grandis) ⽖和⾏⾛腿的硬度已通过显微压痕法测量。外⽪层区域的显微硬度（位于染⾊表⾯下⽅）⽖⼦和步⾏腿分别为 947 ± 74 MPa 和 247 ± 19 MPa，并且它在内⽪层 中下降到这些值的⼀半左右（Chen 等⼈，2008），与我们的解释⼀致。
在被⽅解⽯矿化的 Tyloseuropaeus Arcangel 的⻆质层区域中也测定了⽐被 ACC 矿化的⻆质层区域更⾼的弹性 模量和纳⽶硬度值（Seidl 等⼈，2018）。
因此，我们的结果强烈⽀持这样⼀个⽅⾯，即 ACC 相不仅是结晶相的前体，⽽且它在需要外⻣骼柔韧性的地⽅起着重要的结构作⽤。钙化和结晶率之 间的相关系数为 0.52，表明外⻣骼机械性能的两种不同调节机制之间存在微弱的关系，即较⾼的 CaCO3积累及其结晶质量。
然⽽，⽬前还不能对这个⽅向作出明确的结论。
研究 · 结论
从 Calappa granulata 外⻣骼的不同部分记录拉曼和 NEXAFS 光谱，以确定结晶和钙化程度的变化。从⽩⾊区域记录的拉曼光谱仅显⽰归因于 CaCO3 的峰，⽽在彩⾊部分的光谱中出现 AXT 发⾊团特征峰。
在右⼿掌和⼿指的CaCO3 主峰中，仅检测到来⾃⽅解⽯的贡献。然⽽，在外⻣骼的其他部分，结晶相和 ACC 相共存，它们的相对含量在外⻣骼的不同部分不同。
这可能表明⾮晶相不仅是结晶相的前体，⽽且在调节外⻣骼的机械性能⽅⾯也起着⾄关重要的作⽤。Ca L3,2-edge NEXAFS 光谱完全⽀持拉曼光谱结果。
在L3和L2主峰的低能量区域观察到的次级峰的强度和能量差的变化与 ACC 相和结晶相的共存⼀致。L2分裂与通过拉曼光谱获得的结晶度线性相关。
遵循以下关系：（结晶⽐）= −3.01 + 3.28，因此能够估计其他钙化组织中的结晶含量，其中⽅解⽯和ACC 阶段共存。在整个外⻣骼的钙化范围内也观察到变化。发现钙化和结晶之间的相关性相当弱。晶体 CaCO3 的⽅解⽯结构也⽤ TEM 验证。
*如对内容有异议，点击“阅读原文”查看期刊原文。© 2020 Elsevier Inc. All rights reserved.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jsb.2020.107557
