前言
本篇由北京农学院姚允聪课题组在New Phytologist期刊(IF=10.323)发表的题为“The MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR module regulates the homeostasis between anthocyanin and lignin biosynthesis during light induction in apple”的研究成果，通过对‘Stolav’苹果进行套袋处理，发现了套袋解除后光照下苹果表皮花青苷显著积累，探究了苹果中调控木质素合成关键基因cinnamoyl-coenzyme A reductase gene (CCR)的micro RNA-miR7125以及转录抑制子MdMYB16和转录激活子MdMYB1对miR7125的调控机制，丰富了miRNA参与光信号通路调控苹果色泽的研究机制，为非编码RNA在植物响应非生物胁迫调控机理的研究和应用提供了理论依据。
基本信息
中文标题：MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模块调节苹果光诱导过程中花青素和木质素生物合成之间的稳态
研究对象：苹果
发表期刊：New Phytologist
影响因子：10.323
发表单位：北京林业大学北京林木分子设计育种高精尖创新中心；北京农学院植物科学与技术学院；北京市农业应用与新技术重点实验室
运用生物技术：qRT-PCR，农杆菌瞬时表达，生物膜干涉技术Biolayer interferometry (BLI)、转录组测序、small RNA测序
研究背景
光是影响苹果果实发育、成熟和衰老的重要信号和环境因子之一，并在果实次生代谢物质合成中发挥关键作用。光信号激活苹果果实花色苷合成，从而影响果实的色泽和外观品质。木质素和花色苷含量的多少是影响苹果食用品质和外观品质的重要指标。然而，对于苹果果皮在光诱导过程中着色与木质化的关系及相互作用的研究却很少。本研究前期发现，苹果果皮花色苷含量在果实脱袋之后显著升高，而木质素含量在脱袋之后显著降低。然而，在光诱导条件下，两者之间是否产生相互作用而影响苹果脱袋后的品质发育尚不清晰。
研究路线
研究方法
1.实验分组/研究材料
（1）套袋组（黑暗处理，对照）：采后套袋苹果。
（2）弱光处理组（处理一）：采后套袋苹果，去除袋子，用硫酸盐纸袋包装。
（3）强光处理组（处理二）：采后套袋苹果，去除袋子。
（4）处理时间：在处理后0、2、4、6和15 d，取树周大小相近的苹果果实果皮进行取样。
2.技术路线
2.1 转录组和miRNA组分析：取光照处理2 d的苹果果皮样品进行转录组和miRNA组测序。
2.2 花青苷和木质素含量分析：测定对照组，处理一和处理二苹果果皮花青苷和木质素含量。
2.3 基因相对表达量变化分析：计算木质素和花青苷代谢通路关键基因在对照组，处理一和处理二中的相对表达量。
2.4 miR7125靶向MdCCR关系分析：5‘RACE
2.5 miR7125和MdCCR功能分析：农杆菌瞬时表达苹果
2.6 miR7125启动子功能分析：生物膜干涉技术Biolayer interferometry (BLI)
研究结果
1. 不同光强处理后苹果果实颜色的表征
如图1所示，光照处理显著促进苹果果皮花青苷积累，且积累量随光强增加而增加，木质素含量则随光强增加而减少。光照处理下，苹果中花青苷合成关键基因 的相对表达量随光强增加而增加；而木质素合成关键基因和相对表达量随光强增加而减少。
图1 | 不同光强处理后苹果果实着色特性
2. 不同光强处理下苹果花瓣、叶片、绿皮、果肉和果皮中miR7125和MdCCR表达水平的qRT-PCR分析
如图2所示，随着光照强度增加，mdm-miR7125相对表达量显著升高，MdCCR（肉桂酰辅酶A还原酶基因）的相对表达量显著降低。随着苹果花从芽到盛花发育阶段，花青苷含量逐渐降低，mdm-miR7125相对表达量显著降低，MdCCR的相对表达量显著升高。mdm-miR7125和MdCCR在苹果叶的表达量显著高于绿色表皮和果肉。
图2 | 不同光强处理下苹果花瓣、叶片、绿皮、果肉和果皮中miR7125和MdCCR表达水平的qRT-PCR分析
3. 苹果果实中miR7125和MdCCR表达的鉴定
如图3所示，RLM-RACE结果表明MdCCR是miR7125的直接靶标，其裂解位点位于互补区域内的第4和第5碱基之间(图3a,b)。MdCCR基因的CDS，全长648 bp，编码215个氨基酸(与金香苹果中已发表的MdCCR序列一致)，包含3个保守基序，包括CCR超家族的碳域和硫氧还蛋白超家族的氮域(图3c,d)。如图3(e)结果显示， PbCCR与MdCCR关系密切，一致性为98%。
图3 | 苹果果实中miR7125和MdCCR表达的鉴定与表征
4. 在摘袋后的套袋苹果中过表达mdm-miR7125和干扰MdCCR功能分析
如图4所示，在收获的套袋苹果摘袋后，分别过表达mdm-miR7125，干扰MdCCR表达，以及同时过表达mdm-miR7125和干扰MdCCR表达，苹果表皮花青苷显著积累，木质素含量显著下降。在这三种处理条件下，MdCHS等花青苷合成关键基因显著上调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著下调表达。
图4 | NILTeo和NILB73的氮素利用率
5. 在摘袋后的套袋苹果中干扰mdm-miR7125和过表达MdCCR功能分析
如图5所示，在收获的套袋苹果摘袋后，分别干扰mdm-miR7125表达，过表达MdCCR，以及同时干扰mdm-miR7125表达和过表达MdCCR，苹果表皮木质素显著积累，花青苷含量显著下降。在这三种处理条件下，MdCHS等花青苷合成关键基因显著下调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著上调表达。
图5 | 套袋苹果果实采收后MIM7125、CCR-OX、miR7125-RNAi、CCR-OX、miR7125-RNAi + CCR-OX、MIM7125 + CCROX的瞬时转化特征
6.MdMYB16和MdMYB1能够结合mdm-miR7125的启动子
如图6所示，套袋苹果摘袋后，MdMYB16的表达量随光强增强而显著降低；MdMYB1的表达量随光强增强而显著升高。相关性分析表明，MdMYB16与木质素，花青苷，mdm-miR7125和MdCCR呈显著负相关关系；MdMYB1与木质素，花青苷，mdm-miR7125和MdCCR呈显著正相关关系。生物膜干涉技术Biolayer interferometry (BLI)结果表明，MdMYB16和MdMYB1主要结合在mdm-miR7125启动子的“CAACAG”元件（MYB结合位点，MBS）位置。
图6 | 苹果中MdMYB16和MdMYB1与miR7125启动子结合
7.在摘袋后的套袋苹果中过表达和干扰MdMYB16功能分析
如图7所示， 在收获的套袋苹果摘袋后，过表达MdMYB16，苹果表皮木质素显著积累，花青苷含量显著下降；其中，MdCHS等花青苷合成关键基因显著下调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著上调表达。在收获的套袋苹果摘袋后，干扰MdMYB16表达，苹果表皮花青苷显著积累，木质素含量显著下降；其中，MdCHS等花青苷合成关键基因显著上调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著下调表达。
图7 | 苹果采收后套袋后MYB16-OX和MYB16-RNAi的果实表型、qRT-PCR分析、果皮花青素含量、果皮木质素含量、花青素通路相关基因等表达变化特征
8. MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模块调控苹果光诱导过程中花青素和木质素生物合成的内稳态
如图8所示，光照条件下，苹果表皮中MdMYB1表达量升高，MdMYB16表达量下降，使更多的MdMYB1结合在mdm-MIR7125的启动子MBS元件上，从而激活mdm-miR7125的表达使其表达量升高，进一步靶向降解木质素合成关键基因MdCCR，最终降低苹果果皮中木质素的合成，促进花青苷积累。黑暗条件下，苹果果皮细胞中MdMYB16表达量升高，直接导致mdm-miR7125的表达量降低，MdCCR表达量升高，最终导致木质素含量升高，花青苷合成通路被抑制。
图8 | MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模块调节苹果果实光诱导过程中花青素和木质素积累平衡的机制工作模型
研究结论
当果实感知光信号时，调控花青素生物合成的激活子MdMYB1和抑制子MdMYB16的表达分别显著上调和下调。导致了miR7125的上调和苹果花青素的积累。此外，MdCCR转录水平受miR7125调控，显著降低，导致木质素生物合成降低。最后，相对较多的底物和通量从木质素途径转向花青素的生物合成，导致苹果变色。综上所述，姚允聪团队的研究揭示了由MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模块驱动的苹果光诱导过程中花青素和木质素合成之间的内稳态调控机制。同时也强调了未来利用代谢灵活性调节果实特定品质的可能性和可行性。
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姚允聪团队作为国内苹果花青苷合成通路相关研究的领军人物，为该领域的丰富贡献了不可小觑的力量。miRNA作为转录调控的明星分子，在得到越来愈多的研究。这篇文章从常规的苹果种植工艺——“套袋”着手，先是阐明了光照强度对苹果果皮着色的影响，后结合miRNA测序和转录组分析，发现了能够靶向调控木质素合成关键基因——肉桂酰辅酶A还原酶基因（MdCCR）的mdm-miR7125，以及一个转录抑制子MdMYB16，首次提出了MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模块驱动的苹果光诱导过程中花青素和木质素合成之间的内稳态调控机制。
不仅如此，该研究表明，miRNA不仅可以靶向调节转录因子，也可以靶向调节结构基因。生物膜干涉技术Biolayer interferometry (BLI)技术的应用也拓宽了小分子与启动子结合的研究方法。总的来说，该文章的研究结果为指导苹果生产实践中果实着色以及丰富非编码RNA在细胞色素合成领域的理论研究都具有重要意义。
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