单细胞转录组测序继续发力！近日，复旦大学附属中山医院王群教授团队在Oncogenesis (IF 7.480) 发表食管鳞状细胞癌患者手术前使用新辅助化疗手段——紫杉醇加顺铂化疗的单细胞转录网络研究论文，欧易生物提供了该项目单细胞转录组测序相关工作，下面我们一起学习这篇文章的具体内容。
基本信息
材料：5例单纯手术治疗肿瘤组织、5例新辅助治疗肿瘤组织
期刊：Oncogenesis
发表时间：2021年10月
方法： 10× Genomics scRNA-seq、单细胞转录组测序
研究背景和研究目的
食管鳞状细胞癌 (ESCC) 占全世界食管癌病例的90%。虽然新辅助化疗 (NACT-ESCC) 提高了ESCC患者的生存率，但患者的5年生存率仍然较低，约13.9%的ESCC患者在接受NACT联合手术方案后出现复发和远端器官转移，表明ESCC复杂性。因此，这篇文章旨在利用单细胞测序深入探讨肿瘤微环境 (TME) ，帮助我们全面理解单纯手术治疗 (SA-ESCC) 与NACT-ESCC之间的免疫微环境差异，为未来ESCC的治疗提供参考。
内容概述
作者从10个样本中共获得113581个细胞，构建了一个基于SA-ESCC细胞和NACT-ESCC细胞的单细胞网络。作者首先对上皮细胞进行分析研究，发现NACT-ESCC来源的恶性上皮处于“中间过渡状态”。对免疫细胞的分析发现，NACT-ESCC组织中高表达肿瘤相关巨噬细胞（TAM）marker ，同时抗炎marker APOE、APOC1和SPP1在TAM中高表达，表明抗炎型巨噬细胞增多。此外，研究发现ESCC术前是否化疗，其CD8 T细胞有显著差异。
研究内容解析
1. SA-ESCC和NACT-ESCC总单细胞转录图谱
作者从来源于5例SA-ESCC和5例NACT-ESCC患者肿瘤组织中分离113581个细胞进行后续分析 (Fig. 1A)。基于前期研究，借助SingleR数据集、Cellmarker数据库等工具，降维聚类后的细胞被定义为上皮细胞、基质细胞 (成纤维细胞和内皮细胞) 和免疫细胞 (T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞和肥大细胞) (Fig. 1B, C)。各样本细胞分布比例统计结果表明，与SA-ESCC患者相比，NACT-ESCC患者中免疫细胞 (特别是T细胞和B细胞) 的占比更高，而上皮细胞和基质细胞占比明显较低 (Fig. 1D)。这些结果提示NACT治疗后患者抗肿瘤免疫反应增强。
此外，作者探讨了SA-ESCC和NACT-ESCC组以及各组细胞类群之间肿瘤发生中涉及的经典细胞因子和信号通路的表达差异 (Fig. 1E)。细胞因子和NF-kB通路相关基因 (TNFSF13B, IL6和NKFB1) 在单核细胞中的基因表达升高，提示单核细胞在ESCC肿瘤发生中起到关键作用。
Figure 1. SA-ESCC和NACT-ESCC单细胞图谱
2. NACT-ESCC上皮细胞单细胞图谱特征
上皮细胞重降维聚类之后分为7个cluster (Fig. 2A)。通过肿瘤上皮细胞marker (EPCAM, MDK和SOX4)和非恶性上皮细胞marker (KRT5和KRT14) 定义各个亚群 (Fig. 2B)。InferCNVs分析显示，与正常上皮细胞亚群相比，肿瘤上皮细胞亚群的恶性化评分显著更高 (Fig. 2C)。同时，作者还发现非恶性上皮细胞中，SA-ESCC相比于NACT-ESCC非恶性上皮细胞占比更高 (Fig. 2D)。针对恶性与非恶性上皮细胞作差异基因分析，发现与预后差相关的基因 (例如：SOX4和MDK) 主要在SA-ESCC恶性上皮细胞中上调，免疫相关基因 (例如：IGLC2、FABP5和S100A2) 在非恶性上皮细胞中上调 (Fig. 2E)。
此外，非恶性上皮细胞根据来源分为两个亚群 (Fig. 2E)，这表明非恶性上皮细胞的异质性。对上皮细胞进行拟时序分析发现上皮细胞的分化轨迹以SA-ESCC非恶性上皮细胞为起点，之后转变为NACT-非恶性上皮细胞，NACT-恶性上皮细胞处于“中间过渡状态”。随后，上皮细胞的轨迹产生分支，一部分分化为SA-ESCC恶性上皮细胞，一部分分化为不同来源的正常上皮细胞。这些结果揭示了SA-ESCC和NACT-ESCC中上皮细胞复杂的重编程过程。
Figure 2. 非恶性和恶性食管上皮细胞单细胞图谱
3. 构建SA-ESCC和NACT-ESCC单细胞网络
作者通过细胞间相互作用构建单细胞转录网络来探究从SA-ESCC到NACT-ESCC的细胞和分子变化。SA-ESCC中的基质细胞，特别是成纤维细胞，与其他细胞之间存在高度的细胞间通讯交流 (Fig. 3)。相反，NACT-ESCC中的免疫细胞，特别是T细胞和单核细胞在TME中起主要作用。作者还对NACT-ESCC和SA-ESCC中的基质细胞进行代谢分析，发现SA-ESCC中恶性和非恶性上皮细胞中代谢通路富集均上调，例如：TCA循环通路 (Fig. 3)。而在NACT-ESCC组中，这些通路仅在非恶性上皮细胞中上调。这些结果表明，与SA-ESCC相比，NACT-ESCC具有独特的TME，并且根据代谢分析结果，线粒体可能是SA-ESCC的潜在治疗靶点。
Figure 3. SA-ESCC和NACT-ESCC的单细胞转录网络
4. 化疗后肌成纤维细胞和肿瘤内皮细胞水平明显下降
作者接下来对ESCC中的基质细胞进行了分析。对成纤维细胞和内皮细胞重降维聚类，内皮细胞被定义为：免疫EDC、淋巴EDC、肿瘤ED和血管EDC (Fig. 4A)，成纤维细胞被定义为：COL14A1+基质成纤维细胞、肌成纤维细胞和血管平滑肌细胞 (Fig. 4B)。针对EDC，作者发现NACT-ESCC组的肿瘤EDC比例较低，而免疫EDC比例较高 (Fig. 4A)。接下来，作者对肿瘤EDC进行GSVA分析，发现NACT-ESCC肿瘤EDC中的代谢途径被激活 (Fig. 4C)。对免疫EDC进行差异基因分析，发现促癌基因在SA-ESCC中高表达 (Fig. 4D)，而在NACT-ESCC组中，HSP家族基因的表达显著升高。据报道，HSP家族基因过表达促进多种肿瘤的生长和转移，这提示HSP家族基因可能是NACT-ESCC的潜在治疗靶点。
对于成纤维细胞，肌成纤维细胞在肿瘤进展中起到关键作用。与SA-ESCC相比，COL14A1+基质成纤维细胞主要富集于NACT-ESCC，而肌成纤维细胞主要富集于SA-ESCC (Fig. 4B)。α-SMA (ACTA2基因产物) 作为肌成纤维细胞的标记蛋白，能够反映其浸润程度 (Fig. 4E)。此外，与Wnt和Notch信号通路密切相关的POSTN和WNT5A在肌成纤维细胞中高表达 (Fig. 4F)。GSVA分析显示Wnt和Notch信号通路在肌成纤维细胞中富集，而COL14A1 + 基质成纤维细胞在抵抗基质微环境中异常应激水平方面发挥着重要作用 (Fig. 4G)。
Figure 4. SA-ESCC和NACT-ESCC中基质细胞的单细胞图谱
5. 巨噬细胞在SA-ESCC和NAT-ESCC中发挥不同的作用
根据CD68和LYZ的表达，共选择16305个髓系细胞重降维聚类，聚类后细胞类型主要包括单核细胞、巨噬细胞、DC和未定义髓系细胞。与SA-ESCC组相比，NACT-ESCC组巨噬细胞水平比例降低，单核细胞比例升高 (Fig. 5A)。SPP1是多种肿瘤的预后不良标志物，在这项研究中，作者发现SPP1主要在巨噬细胞中表达 (Fig. 5B)。拟时序分析进一步阐明了单核细胞到巨噬细胞的转变 (Fig. 5C)。此外，巨噬细胞的GSVA分析显示，与抗肿瘤相关的通路在NACT-ESCC中富集，与促肿瘤相关的通路在SA-ESCC的巨噬细胞中富集 (Fig. 5D)。对NACT-ESCC和SA-ESCC细胞进行SCENIC分析 (Fig. 5E)，NACT-ESCC巨噬细胞中转录因子SPI1和KLF4调节的基因表达水平显著升高 (Fig. 5E)。
这些发现为进一步探索SA-ESCC和NACT-ESCC中的髓系细胞多样性提供了基础。进一步研究单核细胞和巨噬细胞中免疫检查点的分布发现，与单核细胞相比，巨噬细胞中与抑制CD8 T细胞活性相关的基因PDCD1LG2 (PD1-L2)、CD274 (PD-L1)、CD276 (B7-H3) 和LAG3的表达升高 (Fig. 5F)。与巨噬细胞相比，单核细胞中促炎相关免疫检查点基因 (IL1A和IL6) 的表达显著升高。这些marker是髓系细胞免疫治疗的潜在靶点。
Figure 5. SA-ESCC和NAT-ESCC中髓系细胞的单细胞图谱
6. 化疗改变了浆细胞在TME中的作用
基于CD79A和IGKC的表达，共选择2999个B细胞进行下游分析。B细胞重降维聚类后，分为3个cluster (Fig. 6A)。与SA-ESCC相比，NACT-ESCC浆细胞比例增加 (Fig. 6B)。GSVA分析显示，干扰素反应相关途径在NACT-ESCC来源的浆细胞中富集 (Fig. 6C)。通过SCENIC分析浆细胞和滤泡B细胞中基因表达差异的潜在调控因子 (Fig. 6D)，STAT3调控的基因在滤泡B细胞中表达水平升高，而在浆细胞中，特别是NACT-ESCC患者浆细胞中，ATF3表达水平较高。这些发现表明B细胞在NACT-ESCC和SA-ESCC患者中具有复杂的调控网络。
Figure 6. SA-ESCC和NAT-ESCC中B细胞的单细胞图谱
7. SA-ESCC和NAT-ESCC患者中CD8 T细胞的显著差异变化
根据CD3D和CD3E的表达，共筛选出36706个T细胞重降维聚类，根据经典marker的表达，共鉴定出六种细胞类型 (Fig. 7A)。与SA-ESCC中的T细胞亚型相比，NACT-ESCC患者的CD8 T细胞水平显著升高。此外，在NACT-ESCC中观察到NKT、Th和CD4T占比明显更低 (Fig. 7B)，且CD4 T细胞表现出相对较高的naïve和co-stimulatory marker的表达 (Fig. 7C)。作者接下来对NACT-ESCC和SA-ESCC之间T细胞亚型的相似性进行分析，结果发现NACT-ESCC和SA-ESCC中CD8 T细胞中存在显著差异 (Fig. 7D)。对CD8 T重新降维聚类，定义聚类后细胞为cytotoxic CD8 T细胞, exhausted CD8 T细胞和naïve CD8 T细胞 (Fig. 7E)。NACT-ESCC中exhausted CD8 T细胞和naïve CD8T细胞水平显著升高，这意味着化疗改变了ESCC的TME。以上结果表明，NACT-ESCC和SA-ESCC患者之间CD8 T细胞的不同激活/衰竭状态。
Figure 7. SA-ESCC和NAT-ESCC中T细胞的单细胞图谱
作者进一步利用拟时序分析CD8 T细胞群的过渡状态 (Fig. 8A，B)，整个拟时序轨迹上，呈现出由naïve CD8 T，cytotoxic CD8 T到exhausted CD8T细胞的变化。同时，作者发现，来自SA-ESCC患者的CD8 T细胞主要为naïve CD8 T和cytotoxic CD8 T，而随着拟时序时间的发展， NACT-ESCC患者的exhausted CD8 T细胞逐渐增加(Fig. 8C，D)。尽管在NACT-ESCC和SA-ESCC样本的CD8 T细胞中观察到相似的变化轨迹，但其具有不同的免疫和转录状态，这表明SA-ESCC和NACT-ESCC患者的治疗应考虑不同的免疫治疗策略。
接下来，利用SCENIC分析参与T细胞转变的转录因子 (Fig. 8E)，发现在NACT-ESCC中的CD8 T细胞中ELF1、JUNB和FOSB上调，而在SA-ESCC中，这些TF下调 (Fig. 8E)。有趣的是，LAG3和HAVCR2与T细胞活性相关，它们在NACT-ESCC和SA-ESCC exhausted CD8 T细胞中均高表达 (Fig. 8F)。这些发现表明SA-ESCC和NACT- ESCC的免疫治疗反应具有显著的异质性。
Figure 8. SA-ESCC和NAT-ESCC中CD8T细胞的单细胞图谱
文章结论
这篇文献的作者通过对ESCC患者术前是否接受NACT治疗的单细胞数据进行比较分析，全面研究了NACT-ESCC和SA-ESCC来源的上皮细胞、基质细胞、免疫细胞的异质性，并探讨了是否接受NACT治疗的肿瘤微环境异质性，发现不同治疗手段细胞组成的多样性及分子复杂性，并提出了ESCC治疗的新靶点，为未来ESCC的治疗提供重要的参考。
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