三羧酸循环的最后一步是苹果酸氧化成草酰乙酸，由L-苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）催化。这是第四次氧化，生成NADH。这个反应在能量上不利，由于草酰乙酸的不断消耗，而得以持续进行。
苹果酸的氧化
MDH以二聚体发挥作用，被柠檬酸变构抑制，可被ATP、ADP、延胡索酸、天冬氨酸和高浓度草酰乙酸抑制。
MDH也有不同的细胞定位。线粒体MDH2参与三羧酸循环，细胞质MDH1参与NADH的转运（苹果酸穿梭）过程，联系着糖酵解与氧化磷酸化。有研究认为肿瘤的代谢调控与MDH密切相关（Oncogene. 2017）。
苹果酸脱氢酶参与肿瘤代谢模型，引自Biomol Ther (Seoul). 2018
有很多关于MDH结构与功能的研究，特别是关于其催化机制、底物特异性和热稳定性方面。据报道，来自超嗜热古细菌Pyrobaculum calidifontis的苹果酸脱氢酶Pcal_1699最适温度为90°C，在沸水中加热6小时后仍保留90％以上的活性（Extremophiles. 2016）。
总体来说，每轮循环产生3个NADH，1个FADH2，1个GTP，相当于10个ATP。加上酵解和丙酮酸脱氢，每个葡萄糖有氧氧化共产生30-32个ATP。注意丙酮酸脱氢酶产生的NADH已经在线粒体中，不需要穿梭。
三羧酸循环的一个难点是其不对称反应，或者说是碳原子去向问题。三羧酸循环整体上每轮氧化掉一个乙酰辅酶A，放出两个二氧化碳。但具体到每一轮反应，放出的二氧化碳来自草酰乙酸的1、4位，新加入的乙酰辅酶A并不会生成二氧化碳。乙酰辅酶A的1位碳原子进入新生成的草酰乙酸1位或4位，下一轮放出；其2位碳则进入新生草酰乙酸的2位或3位。每一轮中，草酰乙酸的3位进入新生草酰乙酸的1、4位，下一轮放出；2位则进入2、3位，即有一半几率在两轮后放出。
三羧酸循环中碳原子的去向
三羧酸循环的作用不仅是氧化乙酰辅酶A，它还沟通糖、脂和蛋白质代谢。氨基酸和许多小分子物质通过三羧酸循环互相转化。所以三羧酸循环的中间物可以作为生物合成的前体，如草酰乙酸和α-酮戊二酸可用于合成天冬氨酸和谷氨酸，琥珀酰辅酶A可用于合成卟啉等。
如果三羧酸循环的中间物被“挪用”过多，就会降低草酰乙酸浓度，抑制三羧酸循环，影响机体能量供应。这时就需要用其它物质补充草酰乙酸，称为“回补反应”。
线粒体中的丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase）可以催化丙酮酸与ATP、水和CO2生成草酰乙酸。反应需要镁离子和生物素。丙酮酸羧化酶是调节酶，平时活性较低，当草酰乙酸不足时，乙酰辅酶A浓度升高，可以促进其活性。
丙酮酸的羧化反应
磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）也可用于回补反应，同时生成一个GTP。反应由磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PCK）催化，有胞浆型的PCK1和线粒体型的PCK2。这是一个可逆反应，在糖异生时催化草酰乙酸生成PEP。
在氨基酸较多时，可以由天冬氨酸转氨生成草酰乙酸，或者由谷氨酸生成α-酮戊二酸，由异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸生成琥珀酰辅酶A，再通过三羧酸循环转化为草酰乙酸。
参考文献：
E A Hanse, et al. Cytosolic malate dehydrogenase activity helps support glycolysis in actively proliferating cells and cancer. Oncogene. 2017 Jul 6;36(27):3915-3924.
Soo-Youl Kim. Cancer Energy Metabolism: Shutting Power off Cancer Factory. Biomol Ther (Seoul). 2018 Jan 1;26(1):39-44.
Ghazaleh Gharib, et al. Pcal_1699, an extremely thermostable malate dehydrogenase from hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum calidifontis. Extremophiles. 2016 Jan;20(1):57-67.
