背景
一些甲壳类动物，特别是淡水小龙虾，通过稳定水库器官——胃石内的无定形碳酸钙 (ACC) 来维持生物可利用的钙，可以很容易提供构建新外骨骼所需的 Ca 2+ 。
尽管生物源性 ACC 的原位分子水平图像及其在生物可利用形式中的稳定性具有关键的科学和生物医学重要性，但迄今为止，其描述仍未得到证实。
研究 · 内容
在小龙虾的完整胃石内，使用多核 NMR完成了 ACC 的原位分子水平表征。
除了已知的 CaCO 3、甲壳素支架和无机磷酸盐 (Pi)，还在胃石中识别出两种主要代谢物柠檬酸盐和磷酸烯醇丙酮酸 (PEP)，并通过将溶液 NMR 技术应用于胃石“可溶性基质”来量化它们的丰度。
应用固态旋转回波双共振 (REDOR) 和转移回波双共振 (TEDOR) 确定胃石内 ACC 稳定、含 P 部分的物理化学状态。
固态核磁共振波谱被证明是原位确定成分、内部结构和分子功能的可靠且易于使用的方法。
研究 · 结果
除了这个最明显的碳酸盐峰外，完整胃石的13 C CP MAS 光谱（图 1 B，垂直扩展）揭示了一大组由其生物有机含量引起的峰。通过结合固态和溶液 NMR 技术来识别产生这些峰的分子及其完整归属。完整的胃石通过浸入 EGTA 溶液中脱钙，溶解 CaCO 3和其中所含的一些物质，形成称为“可溶性基质”的溶液（SI 文本）。
以固体形式留下的几丁质支架和不溶性物质称为“不溶性基质”（图 1 E）。冲洗和干燥的不溶性基质的 C CP MAS 光谱（图 1 C）是 α-几丁质的光谱，已知它构成胃石多糖支架。在完整胃石的光谱中也可以看到所有几丁质峰（图 1B ）。然后通过 1D 和 2D 多核 ( 1 H、13 C 和31 P) 溶液 NMR 光谱表征可溶性基质，如SI Text中详细描述的。
除 Pi 外，该表征还鉴定了主要代谢物 PEP 和柠檬酸盐。通过 PEP、柠檬酸盐和 Pi 的加标实验证实了它们的鉴定（SI Text）。对于完整的胃石，可以清楚地看到由 PEP 和柠檬酸盐产生的峰（图 1B ）；然而，它们不存在于不溶性基质的光谱中（图 1 C）。
因此，这些观察结果将 PEP 和柠檬酸盐主要定位在可溶性基质中。如果它们也出现在不溶性基质中，它们的残留水平低于实验灵敏度。PEP 和柠檬酸盐是主要代谢物，其中只有柠檬酸盐因其螯合钙离子的能力而与生物矿化活性有关 ( 12 , 42 )。
图1
13C MAS NMR spectra of intact gastrolith of the crayfish C. quadricarinatus (A and B) and of the decalcified gastrolith (C). (A) DE MAS, fully relaxed spectrum (40-min repetition delay); (B) CP MAS spectrum and its vertical expansion (× 4) with peak assignment of the bioorganic content. (C) CP MAS spectrum of the decalcified gastrolith showing the insoluble matrix. (Top) Molecular structures of the chitin repeat unit and of PEP and citrate. (D and E) Photos of the intact and of the decalcified gastrolith.
完整胃石的磷含量在31 P CP MAS 光谱中很明显（图 2 A，底部），表示为两个主要的、部分分辨的峰。可溶性基质的31 P 溶液 NMR 光谱（图 2 A）的分辨率增加，清楚地显示了两个峰，分别标识为 Pi 和 PEP。
对不同胃石的表征表明，发现“可溶”部分中的总 P 含量在 6 到 18 P/Ca mol% 之间变化，该范围类似于早期的电感耦合等离子体原子发射光谱 (ICP-AES) 报告（17）。
可溶部分中的 Pi 水平为 4-16 mol% (Pi/Ca)，而 PEP 水平为 0-4 mol%。相对 PEP/Pi 比率在 0-70% 的范围内变化。
使用了 2D NMR 实验， 31 P → 13 C 2D-HETCOR（异核相关）（24 × 24 T R TEDOR（转移回波）双共振）混合，SI 文本）（43 - 45）。
2D-HETCOR NMR 谱图（图 2 B) 清楚地显示了 Pi 和 PEP 与 ACC 的碳酸盐之间的交叉峰。这表明这两种物质都在 ACC 中以分子形式分散，如图2C所示。
图2
(A) 31P NMR spectra. (Bottom) 121.5-MHz CP MAS spectrum of intact gastrolith of C. quadricarinatus showing two partially resolved peaks assigned to Pi and PEP. (Top) 161.3-MHz solution NMR of the soluble matrix. Solution chemical shift values of phosphates are pH dependent and are different from the in situ values (SI Text). (B) 31P → 13C 2D-HETCOR MAS NMR spectrum of intact gastrolith of the crayfish C. quadricarinatus showing connectivity between Pi to ACC carbonate and between PEP phosphate to ACC carbonate. 1H to 31P contact time of 2 ms and 24 × 24TR TEDOR mixing were employed. (C) A schematic drawing of ACC with Pi and PEP molecularly dispersed.
完整胃石的 64 T R 13 C{ 31 P} CP-REDOR 参考光谱（图 3 A；S 0）显示了所有13 C 碳，如之前在13 C CP MAS 光谱中看到的（图 1 B）。
它的 REDOR 差异光谱（图 3 B；ΔS ）仅揭示了位于ca范围内的那些碳（所有分子成分） 。Pi 或 PEP 的 9 Å 磷原子；9 Å 是最大可检测距离。
在该 REDOR 差异光谱中最明显的是碳酸盐峰（图 3 C），其相对强度 Δ S / S 0约为 50%。这一观察结果表明，ACC 超过一半的碳酸盐碳报告了这种接近性。进行 REDOR 实验作为 REDOR 偶极演化时间的函数显示单调增加（图 3 D) 的碳酸盐差异峰 (Δ S / S 0 )。
这些观察结果只能用磷——胃石的次要成分——分子分散在主要成分——ACC中来解释。
被碳酸盐“海洋”包围的磷（Pi，PEP）的设想情况表明分布31 P⋯ 13 C 距离。CaCO 3 :H 2 O ( 1:1 ) 模型球体的计算 REDOR 演化曲线 ( SI Text , p. 2 )，其中31 P 位于其中心，表明半径为 8-9 Å 的球体与实验结果非常吻合数据（图 3 D）。
图3
13C{31P} CP-REDOR MAS NMR spectra (64TR; 12.8 ms) of intact gastrolith of the crayfish C. quadricarinatus. (A) S0 reference spectrum: accounts for all carbon species; (B) ΔS difference spectrum: shows peaks only for species that are within 9 Å from a P atom of Pi or PEP. (C) Expanded carbonate region: shows a 50 ± 2% REDOR difference peak. (D) Experimental (points; two gastroliths) and simulated REDOR ΔS/S0 evolution curves; simulations are for 1∶1 CaCO3∶H2O spheres (R = 7, 8, 9, 10 Å) with a central P atom, accounting for 13C⋯31P distance distribution (SI Text).
"
检查了13 C{ 31 P} CP-REDOR 实验中剩余的13 C NMR 峰（图 3 A和B）。丰富的磷酸化代谢物 PEP 的三个碳原子与磷酸盐分子内接近。
C 2是最接近 PEP 磷酸盐的（约 2.7 Å），显示出预期的 100% REDOR 差异峰（148.5 ppm）。
PEP的 C 1和 C 3共振（分别为 172 和 103 ppm）与碳酸盐 ACC 和 C 1的峰重叠 甲壳素的含量，因此无法准确确定其 REDOR 峰的相对强度。
接下来，柠檬酸盐羧酸盐（C 1和 C 4，以 182 ppm 为中心）表现出 75 ± 5% 的 REDOR 差异峰（图 3）。
其他柠檬酸盐碳 C 2和 C 3也显示 REDOR 差异峰；然而，由于有限的 S/N 和部分重叠的几丁质峰，它们无法量化。羧酸盐碳的 REDOR 数据的几何含义是，它们中的 75% 距离31个 P 物种大约 4.5 Å，或者全部距离 P 物种大约 5 Å（SI Text，p.2）。
柠檬酸盐羧酸盐与 Pi 和/或 PEP 磷酸盐的这种紧密的分子间排列，都带负电，必须由阳离子介导，可能的候选者是最丰富的 Ca 2+。目前的数据无法确定柠檬酸盐是否也分散在 ACC 中或作为分离相存在。
研究 · 结论
NMR表征显示了每种生物如何通过微调P级掺入来指导和稳定碳酸钙的非常不同的功能结构。
以直接的方式原位应用常规和稳健的 NMR 技术，以获得对 ACC 内无机和小生物有机分子的结构组织的独特的分子水平见解，从而使其稳定，这应该会影响进一步的研究和应用，从功能的合理设计提高钙生物利用度。
无定形钙 (ACC)——热力学亚稳态无定形 CaCO 3，在热力学上是最不稳定和最易溶解的形式，具有广泛的结构变异性，被证明在生物矿化的形成过程中起着重要的前驱体作用。
例如，ACC 已被证明是一种瞬态形式，旨在自发演变成具有雕刻形态的预设特定结晶形式。
研究还表明，ACC可以稳定保持在高度可溶的无定形状态，在这种情况下，钙可以很容易地回收，从而确保其更高生物利用度。
原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1102608108
