NK细胞，即自然杀伤细胞，因在先天免疫中表现出抗肿瘤的活性，而被应用于肿瘤治疗的研究当中。本篇文章就NK细胞抗击肿瘤的机制，肿瘤逃逸NK细胞杀伤机制，和NK细胞在免疫治疗中的研究进展，三个方面进行了详细的介绍。让我们一起来看一看吧。
作为周一的下饭文章，本篇文章篇幅很长，涉及到的专业知识比较多，如果想快速阅读，直接浏览绿色的字体就可以啦。
NK细胞是关键的先天免疫细胞，是抵御病毒感染和癌症的第一道防线。
虽然NK细胞可以区分“自我”和“非我”，识别异常细胞，并实时清除转化的细胞和恶性肿瘤，但肿瘤有几种策略来逃避NK细胞的攻击。这些策略包括上调NK细胞抑制性受体的配体，产生可溶性分子或免疫抑制因子。
目前，各种类型的NK细胞疗法正被应用于临床试验，包括自体或异体NK细胞、脐带血(UCB)或诱导多能干细胞(iPSC)来源的NK细胞、记忆样NK细胞和NK细胞系NK-92，用于治疗不同类型的肿瘤。与T细胞不同，NK细胞缺乏T细胞受体(TCR)，不会导致移植物抗宿主病(GVHD)，因此CARs-NK细胞疗法因其重定向特异性和有效的抗肿瘤活性而显示出巨大的潜力。
这里小编就NK细胞抗肿瘤机制，肿瘤逃避NK细胞识别的机制和NK细胞免疫治疗的现状和进展作一个介绍。
1. NK细胞抗肿瘤机制
图1. 激活和抑制NK受体及其相应的配体
NK细胞的效应功能受到抑制性受体和激活性受体之间平衡的严格控制（图1）。
NK细胞的一个基本功能是清除主要组织相容性复合体(MHC；也称为人类白细胞抗原(HLA))I类分子表达减弱或缺失的细胞。NK细胞通过抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)与MHCI类分子结合，从而传递强烈的抑制信号来阻断NK细胞的激活，从而最大限度地减少NK细胞对健康自身细胞的破坏。一旦病毒感染细胞或恶性转化细胞失去其MHCI类分子，这些激活的NK细胞受体，如NKG2D、NKp30、NKp46和NKp44，可以识别靶细胞上表达的应激诱导配体，从而为NK细胞杀伤靶细胞提供积极的信号。
NK细胞具有三方面抗癌作用机制：
a. 通过释放穿孔素和颗粒酶或通过死亡受体直接杀伤肿瘤细胞；
b. ADCC作用：NK细胞能够与肿瘤细胞表面的抗体相结合，发挥细胞毒性作用杀死靶细胞；
c. 通过分泌细胞因子和趋化因子，调节天然和获得性免疫细胞间接杀伤病变细胞。
2. 肿瘤逃避NK细胞免疫监视的机制
虽然NK细胞是天然抗癌免疫的主要组成部分，但肿瘤发展出各种策略来逃避NK细胞的攻击或削弱NK细胞的活性和功能。这些策略对NK细胞治疗的疗效有很大影响。
“激活性NK细胞受体”的配体表达下调和“抑制性NK受体”的配体的表达上调
激活NK细胞受体的配体表达下调是肿瘤对NK细胞产生抗药性的机制之一。例如，急性髓系白血病(AML)中具有干细胞特性的白血病细胞NKG2D配体低表达或不表达。在免疫压力下，肿瘤细胞也经常上调抑制性NK受体的配体的表达，如KIR2DL4的配体 HLA-G，以逃避NK细胞介导的细胞毒性作用。
肿瘤细胞产生可溶性分子或配体
肿瘤逃避NK细胞监视的另一个重要机制与肿瘤细胞产生的可溶性分子或配体有关。IL-2是NK细胞增殖和活化所必需的。然而，肿瘤产生的可溶性IL-2Ra可以与IL-2结合，并阻止其与NK细胞膜表面的IL-2R结合，导致对外源性IL-2给药不敏感和NK活性受损。NK细胞功能受损也被报道与可溶性配体水平升高有关，如NKp30的BAG6，NGK2D的MICA和ULBP1-3。从肿瘤细胞脱落的可溶性配体阻止NK细胞识别肿瘤细胞膜上的配体。
肿瘤微环境(TME)
肿瘤逃逸的主要机制与肿瘤微环境(TME)有关。
TME由免疫抑制细胞(如调节性T细胞(Tregs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)、可溶性因子、肿瘤细胞或抗原提呈细胞上表达的抑制分子和细胞外基质组成。
免疫抑制的微环境不仅促进肿瘤的生长和迁移，而且帮助肿瘤细胞逃避宿主免疫的监视，抵抗免疫治疗。肿瘤细胞分泌多种免疫抑制因子，如TGF-β、 IL-10、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)和前列腺素E2(PGE2)，抑制NK细胞抗肿瘤活性。肿瘤细胞来源的IDO和PGE2已被证明显著抑制NK细胞的细胞毒作用和细胞因子的产生。几种抑制性细胞如Tregs、MDSCs和M2-巨噬细胞可以通过分泌IL-10和TGF-β来削弱瘤内NK细胞的细胞毒作用。TME中的肿瘤细胞、抗原提呈细胞和基质细胞表达高水平的抑制分子，如PDL1，通过与它们各自的NK细胞上的抑制受体连接来阻止NK细胞的激活，从而导致NK细胞功能障碍甚至衰竭。因此，肿瘤浸润的NK细胞通常呈现衰竭状态，易发生凋亡；其特点是激活受体表达减少，抑制性受体(如NKG2A、TIGIT、TIM-3) 表达上调，IFN-γ和TNF-α分泌减少。阻断这些抑制性检查点受体可以使NK细胞从衰竭状态中恢复过来，并显著提高免疫治疗的疗效。
为了获得理想的NK细胞抗肿瘤免疫治疗效果，必须设计合适的策略来克服肿瘤免疫逃逸机制，特别是克服免疫抑制的微环境。
3. 利用NK细胞进行肿瘤免疫治疗的现状与进展
由于NK细胞在一线免疫应答中起关键作用，且作用迅速，因此越来越多的研究集中在以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗上。以NK细胞为基础的癌症治疗的主要方法包括细胞因子、抗体，以及通过改善NK细胞的持久性、活化、数量或肿瘤细胞靶向性而过继转移体外NK细胞（图2）。
图2 NK细胞免疫治疗方法
体外活化的自体或异体NK细胞治疗
通过过继免疫疗法治疗肿瘤的最初尝试包括转移来自IL-2激活的自体NK细胞，因为这些细胞已被证明可以减少小鼠模型中肺转移癌细胞的生长。然而，当该方法用于临床时，仅观察到有限的抗肿瘤作用，其主要原因是肿瘤细胞表面的自身HLA分子与自体NK细胞表面的KIRs相匹配，从而抑制了NK细胞的活性。
后来，KIRs配体不匹配的同种异体NK细胞被采用，以克服由于肿瘤细胞的“丢失自我”识别造成的这种抑制。输注同种异体NK细胞减少了移植的宿主排斥反应，同时消除了白血病复发，从而确保了有效性和安全性。一些临床试验表明，NK细胞输注耐受性良好，没有移植物抗宿主病(GVHD)、细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；同种异体NK细胞输注的有效性也已被评估，通常在实体瘤中与抗体治疗相结合。
例如，在治疗晚期胃癌或结直肠癌患者的I期临床试验中，过继的NK细胞疗法与曲妥珠单抗或西妥昔单抗或化疗相结合。6名患者中有4名病情进展稳定。联合治疗显著促进了IFN-γ的产生，减少了外周Tregs的数量，从而导致这四名稳定患者中的三名肿瘤体积缩小。
在另一项I期临床试验中，异体NK细胞输注联合西妥昔单抗治疗胃肠道癌肝转移，9例患者中有3例有客观的临床反应。
这些试验中反应差的常见问题与供者体内NK细胞寿命有限(通常为两周)以及与IL-2注射相关的Tregs增加有关。
两个临床试验(NCT00274846和NCT01106950)在输注NK细胞治疗AML时使用IL-2-白喉融合蛋白来消除Tregs。结果表明，IL-2-白喉融合蛋白治疗提高了完全缓解率和无病存活率，这与Treg的有效耗竭、供者NK细胞的增殖和较高的血清IL-15水平有关。
通过给予外源性IL-15而不是IL-2，治疗效果可能会进一步提高，因为IL-15不能促进Tregs的存活和扩张。
脐带血或诱导多能干细胞来源的NK细胞用于肿瘤免疫治疗
除外周血NK细胞外，脐带血（UCB）和诱导多能干细胞(iPSCs)，通过与支持性饲养层细胞共培养，或单独刺激结合细胞因子的方式，也可作为功能性NK细胞的来源。
UCB或iPSCs的优势，如可获得的来源广泛，以及在GMP标准下易于临床级别的扩展，将使UCB或iPSCs来源的NK细胞成为癌症免疫治疗的“现成”产品。
UCB或iPSCs来源的NK细胞的抗肿瘤活性已经在各种类型的肿瘤上进行了评估，包括血液病和实体瘤。
目前有五项临床研究集中在脐带血来源的NK细胞用于治疗复发或难治性血液病和实体肿瘤。目前有四项研究(NCT01729091、NCT03019640、NCT02280525和NCT03539406)正在招募患者。其中一项试验(NCT00354172)已经完成研究。本临床研究旨在寻找 CLL患者化疗时可耐受的最高NK细胞剂量，并了解NK细胞的加入是否能有效治疗本病。临床结果显示，15例血液病患者中有2例在接受UCB来源的NK细胞输注治疗后无病存活6个月。
Fate Therapeutics公司正在利用人iPSCs来产生NK细胞产品。这种“现成的”治疗方法，有望避免患者个性化治疗方法带来的限制。2018年11月，该公司宣布FDA已经批准iPSCs衍生的同种异体NK细胞疗法(FT500)的IND申请。
基于NK 细胞系的肿瘤免疫治疗
目前已有几个已建立的NK细胞系，包括NK-92、NKL、YT、NK-YS和NKG。其中，NK-92细胞对恶性肿瘤细胞表现出强大和广谱的细胞毒性，是唯一获得FDA批准进行临床试验的细胞株。
NK-92细胞在临床上有很多优势。与同种异体或脐带血来源的NK细胞相比，它们在GMP条件下容易扩增，从而降低了患者的成本。NK-92细胞可以被病毒或非病毒载体有效操纵，以增强其靶向和杀伤活性。临床试验结果证实了NK-92细胞输注的安全性。
NK-92细胞输注的疗效已经在黑色素瘤、肉瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌和急性髓细胞白血病患者中进行了评估。最近的一项使用IL-2激活的NK-92细胞的I期临床试验证明了它们的安全性和可行性，并在7名难治和复发AML患者中有3名患者中显示了较好的应答。
然而，由于这些NK细胞在体内的持久性有限，以NK-92为基础的治疗效果仍然有限，即使反复输注也是如此。此外，由于NK-92细胞来源于非霍奇金淋巴瘤患者，因此必须在输注前对其进行照射才能完全消除其增殖。然而，这种辐射过程严重损害了它们在体内的持久性，以至于它们通常在几天内就不会在体内循环中被检测到。
记忆样NK细胞肿瘤免疫治疗
虽然NK细胞是先天免疫的主要组成部分，但最近的证据表明，NK细胞表现出记忆样的适应性特征。
已经报道了三种具有记忆样免疫反应特征的NK细胞：细胞因子诱导的记忆样NK细胞、CMV特异性NK细胞和肝脏驻留的NK细胞。
记忆样NK细胞的共同特征是：表达较高水平的NKG2C；在体内长期增殖和持续存在；经抗原或细胞因子重新刺激或与肿瘤细胞接触后，IFN-γ分泌增加。
这三种类型的不同之处在于，细胞因子诱导的记忆样NK细胞和CMV特异性NK细胞对靶细胞具有更强的细胞毒作用，而驻留在肝脏的NK细胞表现出较差的脱颗粒活性。
尽管NK细胞免疫治疗已经取得了很大进展，但由于NK细胞在体内的寿命短、细胞毒作用低，临床疗效仍然受到限制。记忆性NK细胞的记忆特性及其在体内的长期增殖和持久性使其有可能成为基于NK细胞的肿瘤免疫治疗的一个新的突破口。
人细胞因子诱导的记忆样NK细胞是通过用IL-12、IL-15和IL-18不同的细胞因子组合预活化人外周血NK细胞而获得的。这些记忆样的NK细胞目前正在临床研究中进行评估，I期临床试验已经完成。
经过短暂的预激活和过继转移，这些NK细胞在异种移植小鼠模型中显示出强大的抗AML活性。在临床研究中，转移的记忆样NK细胞在输注后第7天至第14天增殖并达到高峰，而且与输注后第一天(第1天)相比，第7天平均扩增了419倍。另外扩增的记忆样NK细胞显示出强大的抗白血病功能。转移了记忆样NK细胞的9名AML患者中有5名获得临床应答，4名完全缓解。到目前为止，细胞因子诱导的记忆样NK细胞的有效性只在AML患者中进行了测试。其他类型的肿瘤-特别是实体肿瘤仍有待评估。
2019年1月29日，中国科学技术大学的田志刚院士课题组在“Immunity”杂志在线发表了题为Liver-resident NK cells control antiviral activity of hepatic T cells via PD-1/PD-L1 axis的论文，该研究发现肝脏驻留NK细胞能负调T细胞的抗病毒免疫应答，并揭示了其功能发挥的机制。在这项研究中，研究人员利用LrNK细胞（Liver-resident NK，LrNK，简称“驻留NK细胞”）缺陷小鼠进行实验，发现对该缺陷小鼠进行病毒感染后，小鼠肝脏中T细胞功能增强，肝脏损伤加重，病毒滴度减少。对正常小鼠或LrNK细胞缺陷小鼠外源输注LrNK细胞则可以抑制肝脏中抗病毒T细胞应答，经典NK细胞则对T细胞应答具有促进作用。因此人肝内驻留NK细胞有望成为肝癌或相关慢性肝病免疫治疗的候选NK细胞。
CAR-NK 肿瘤免疫治疗
CAR-T细胞过继免疫疗法在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了显著的疗效效果。针对CD19的CAR-T细胞用于治疗复发性B-ALL和某些类型的复发性非霍奇金淋巴瘤已经被FDA批准。
然而，仍然有一些障碍困扰着这一临床应用。输注CAR-T细胞通常伴随着副作用，如CRS、神经毒性和靶上/肿瘤外效应。为了预防GVHD，CAR-T细胞通常是从患者的自体血液中提取的T细胞，这使得制备过程个性化、耗时和昂贵。
CAR-NK细胞有几个优点可以克服这些限制。
由于CAR-NK细胞足够安全，在输注同种异体时引发移植物抗宿主病的可能性很低，因此可以将其制备成“现成”的产品，而不受自体细胞的限制。NK细胞通常分泌有限水平的IFN-γ和GM-CSF，不分泌启动CRS的主要细胞因子IL-1和IL-6。此外，CAR-NK细胞保留其天然受体，如NKp46、NKp30、NKp44、NKG2D和CD226，这些受体可以独立于CAR识别应激诱导的配体，因此，它们可以降低与CAR靶向抗原丢失相关的复发的可能性。
鉴于NK细胞的上述优势，CAR-NK细胞目前正在探索用于血液肿瘤和实体肿瘤的治疗，并显示出巨大的前景。来自加利福尼亚大学圣地亚哥医学院(UCSD)和明尼苏达大学的研究人员就研发出了CAR-iPSC-NK 细胞，与在恶性血液瘤中立下赫赫战功的CAR-T相比，CAR-NK细胞不仅完美继承了CAR-T细胞杀伤肿瘤的战斗力，使得卵巢癌小鼠的肿瘤出现了明显的缩小和衰退，而且更加温柔安全，几乎不存在CAR-T细胞会产生的多项致命副作用，如：神经毒性和细胞因子风暴。可以说是青出于蓝而胜于蓝。
然而，仍有一些限制因素影响CAR-NK细胞的临床成功移植。与T细胞相比，武装CAR-NK细胞是具有挑战性的，因为它对PB来源的NK细胞的转染效率较低，并且在体内持续时间较短。许多研究人员正在探索提高原代NK细胞转染效率的方法，但尚未取得显著进展。
到目前为止，两项用mRNA电穿孔制造CAR-NK细胞的临床试验正在进行，以评估这种疗法的安全性和可行性。一项试验是针对CD19治疗B淋巴系恶性肿瘤(NCT01974479)，由新加坡国立大学卫生系统主办；另一项是使用NKG2D配体靶向CAR-NK细胞治疗转移性实体瘤患者，由广州医科大学第三附属医院于2018年赞助(NCT03415100)。
为了克服CARS瞬时表达和转染效率低的问题，并获得稳定表达CAR的NK细胞，几个小组已经开始使用NK-92细胞或UCB/iPSCs来源的NK细胞作为CAR驱动细胞。
目前已有多项关于CAR-NK的临床试验，这些临床试验多集中于血液肿瘤以及尝试解决CAR-T 未能解决实体瘤的研究。
许多肿瘤抗原被用作CAR-NK细胞研究的靶点，包括来自血液恶性肿瘤的肿瘤抗原(例如CD19、CD20、CD33、CD138和CS-1)和实体肿瘤(例如HER2、erbB2、EpCAM、mesothelin、GD2、GPA7、GPC3、PSCA、EGFR和EGFRvIII)。
第一和第二阶段的五项临床研究(NCT02892695、NCT02742727、NCT02944162、NCT03383978和NCT02839954)集中在淋巴瘤和白血病中表达CD19、CD7和CD33特异性CAR的NK-92细胞、胶质母细胞瘤HER2特异性CAR；MUC1+复发或难治性实体肿瘤的MUC1特异性CAR。
虽然CAR修饰可以提高NK-92细胞对靶细胞的杀伤能力，但由于照射发生在给药前，NK-92细胞在体内的持久性仍然是有限的。有研究者提出了一种从脐血来源的NK细胞中获得CD19特异性CAR-NK细胞的新方法，且该方法可以提高NK细胞在体内的转染效率和持久性。将含有CD19特异性CAR基因和IL-15基因的逆转录病毒载体和可诱导的caspase-9基因修饰NK细胞，以驱动NK细胞的扩增和持续生长。这种修饰，特别是IL-15的引入，与仅转导CAR的NK细胞相比，显著提高了NK细胞在体内的增殖和持久性，并增强了抗肿瘤活性。
由MD Anderson癌症中心赞助的一项临床试验(NCT03056339)于2017年获得批准，旨在评估输注UCB来源的CD19特异性CAR-NK细胞是否会改善患有复发或难治性B淋巴样恶性肿瘤的干细胞移植患者的疾病。
Dragonfly公司开发的肿瘤免疫疗法以专有的三特异性NK细胞衔接蛋白疗法（Tri-specific, NK cell Engager Therapies），即TriNKET™技术。
这是一种将自然杀伤（NK）细胞与癌细胞表面蛋白质相连的结合机制（图3）。
通过这种结合，TriNKET旨在刺激NK细胞，唤醒它们意识到癌细胞，并直接杀死肿瘤细胞。此外，TriNKET通过充当哨兵调用其他免疫系统细胞，激活B细胞产生抗肿瘤抗体，并且激活更多的T细胞杀死肿瘤细胞进而放大T细胞的抗癌效力，还可以通过利用它们区分癌症的特殊特征来扩大治疗窗，从而更有效地靶向肿瘤细胞。
2019年11月20日，艾伯维（AbbVie）与Dragonfly Therapeutics公司宣布了一项研究合作，双方旨在基于Dragonfly公司独有的TriNKET技术平台，进一步推进针对自身免疫疾病和肿瘤适应症的新型NK细胞免疫疗法的开发。
图3. TriNKET作用机制
3.6 与免疫检查点抑制剂联合
在TME中，NK细胞通常处于功能障碍或耗尽的状态，这显著削弱了它们的持久性和细胞毒性。针对TME的策略可能会提高NK和CAR-NK细胞为基础的免疫治疗的疗效。
目前针对NK细胞抑制性受体包括KIR、NKG2A、TIM3、TIGIT等已开发相应抑制剂，其中靶向NKG2A、TIGIT的抑制剂已进入临床研究阶段。
AndréP等人开发了针对NK细胞抑制性受体NKG2A的人源化抗体monalizumab，并在体外评估了monalizumab对各种肿瘤细胞系的潜力，包括HNSCC细胞系和小鼠体内。在一项单独的研究中，Innate Pharma的研究人员报告了一项II期临床试验的中期结果，该试验是monalizumab联合西妥昔单抗（一种抗EGF受体的抗体）治疗头颈癌患者。结果显示，30％的患者在联合治疗后肿瘤负荷减轻。因此NKG2A看起来有望成为有潜力的免疫治疗检查点。
TIGIT在肿瘤浸润的NK细胞和T细胞上高表达，并且TIGIT的水平与肿瘤进展和T细胞和NK细胞的功能衰竭呈正相关，使TIGIT成为重要的检查点受体。
来自中国科学技术大学的田志刚和孙汭教授课题组发表在“Nature Immunology”题为Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity的研究表明虽然NK细胞和杀伤性T细胞表面都含有TIGIT受体，但是NK细胞表面的TIGIT比杀伤性T细胞多很多。
在先天免疫缺陷的小鼠中，即没有T细胞的小鼠模型中，使用TIGIT抑制剂也能延缓肿瘤的生长速度，缩小肿瘤的体积。此研究表明TIGIT抑制剂作用主要针对NK细胞，而不是杀伤性T细胞。因此，通过阻断TIGIT所产生的这种双重作用模式（T细胞和NK细胞共同参与），可能会在临床中扩大可适应的癌症类型，为下一代免疫检查点抑制剂疗法铺平道路。基于该成果，2018年06月22日，中国科学技术大附一院肿瘤免疫治疗研究中心启动其首个项目-NK细胞制剂治疗多线治疗失败恶性肿瘤的临床研究。
2019年7月，美国希望之城国家医疗中心发表在“Cancer Discovery”题为The mechanism of anti–PD-L1 antibody efficacy against PD-L1–negative tumors identifies NK cells expressing PD-L1 as a cytolytic effector的最新研究发现：除肿瘤细胞外，一些癌症患者体内的NK细胞，同样也能够表达PD-L1蛋白，而免疫检查点抑制剂能够促进这类NK细胞杀灭肿瘤。而在免疫检查点抑制剂的作用下，PD-L1阳性的NK细胞将会更加“勇猛”。而在PD-L1抗体的基础上联合NK细胞活化因子，还能再一次显著提高治疗效果。
总结：NK细胞以惊人的抗肿瘤活性最终被转化到临床上，并显示出了非凡的前景。虽然NK细胞在肿瘤免疫中也存在一些问题和挑战，但随着对NK细胞功能的不断深入研究和医学技术的快速发展，通过精心设计的策略，与先进的技术相结合，提高NK细胞的增殖、持久性和功能，克服临床中的瓶颈将会最大限度地发挥NK细胞免疫治疗的效果。我们有理由期待NK细胞在细胞免疫治疗方面的新突破，并在肿瘤治疗上探索出更加有效的免疫治疗新方法，从而最终受益于患者。
本文转自微信公众号：生物制药小编 ，作者南山南。只要分享信息，如有侵权，请联系删除。