因治疗的进步为许多迄今为止无法治愈的疾病有了令人振奋的治疗机会。
前言
AAV全称腺相关病毒，属于细小病毒科的一类很特殊的病毒，它的尺寸非常小，只有20多个纳米，相当于两三个抗体分子。被发现于上个世纪60年代，是发现的比较早的病毒之一，也是目前了解研究最深入的病毒之一，84年的时候就把它作为基因递送的载体。实际上对于重组蛋白药物的发展也就是在上个世纪70年代，也是随着基因工程的出现，开始有了蛋白药物，所以基于AAV的基因治疗跟蛋白药物的发展是前后脚的关系。人们希望病毒携带的基因治疗能代替长期的蛋白治疗。目前上百个不同的AAV基因治疗的产品在临床上试验，进行各种适应症的试验，可以说AAV基因治疗到了华丽的阶段。
AAV人工改造
图 2.腺相关病毒
①AAV（无包膜的单链DNA病毒，基因组4.7kbp） 病毒复制：Rep78、Rep68、Rep52、Rep40； 病毒衣壳：VP1、VP2、VP3； 指导基因组的复制和病毒载体组装：ITRs。 ②rAAV（重组AAV是人工改造的AAV） 删除编码病毒蛋白的基因，保留ITRs； 使得包装容量最大化； 降低免疫原性和细胞毒性。
AAV作为基因治疗载体的优势 ①不导致任何人类疾病，主要以附加体形式存在（非常关键） 迄今为止，许多有害疾病患者已采用了AAV基因治疗，但未观察到重大不良事件，这凸显了这些治疗的安全性。特别是“基因替代”策略在单基因疾病病例中显示出很高的成功率。一些针对血友病A、血友病B、视网膜疾病和脊髓性肌萎缩（SMA）等疾病的临床试验已被证明AAV是安全有效的治疗工具。通过生产更安全（慢病毒）载体，插入诱变的风险已经降低或规避。目前尚不知道野生型AAV在体内引起疾病，并且在去除大多数AAV基因组元素后，可以确保重组AAV基因在体内递送的进一步安全性。 ②免疫原性低（安全） 腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗已在靶器官（包括眼睛、肝脏、骨骼肌和中枢神经系统）的一系列试验中证明了安全性和长期疗效。通过使用辅助免疫调节药物降低了免疫应答的风险。AAV在体内引起非常温和的免疫反应，进一步支持其在基因递送过程中明显缺乏致病性。 ③单次治疗、稳定表达、长期疗效 现在人们普遍认为，AAV介导的蛋白质治疗基因递送提供了持久的药理作用，可能允许整个治疗的单剂量给药。这对于可能需要多次剂量的神经系统和眼部疾病尤其重要。值得注意的是，已有证据表明使用AAV载体治疗多种CNS疾病和脊髓性肌萎缩。AADC在神经元中具有持久（>4年）的转基因表达已在PD患者中得到证实，在非人灵长类动物中已被证明可持续表达>15年。因此，AAV已成为蛋白质治疗基因递送的有前途的平台。 下面介绍一例AAV基因治疗。从基因SMN1的功能拷贝开始，该基因进入到AAV9载体，通过静脉注射给药，整合到脊髓运动神经元的基因组中，治疗性SMN1的转录导致SMN蛋白的表达，减缓疾病进展。
图 3.SMA1的治疗——体内基因治疗
单克隆抗体（mAbs）等蛋白质治疗药物是制药行业中最成功的一类治疗产品之一。多年来，已经开发了不同类型的蛋白质，包括全长免疫球蛋白（IgGs），融合蛋白，单链可变片段（scFvs）和结构域抗体。尽管作为治疗产品非常有效，但这些分子的复杂性使得它们的开发、制造和纯化成为一个昂贵的过程。根据疾病的类型和阶段，蛋白质治疗通常在医院通过静脉输注多次给药。皮下（s.c.）给药是一种可行的替代方法，但除非联合给予特殊的透明质酸酶制剂，否则注射量限制在~5ml。s.c.注射后的生物利用度通常低于100%，这限制了其仅用于剂量有效的蛋白质治疗。 因此，基于单克隆抗体的治疗药物远比小分子药物昂贵，每次治疗的价格为≥10万美元。这些问题限制了患者获得治疗的机会，并阻止了这些分子用于更有效的治疗（即单克隆抗体联合治疗）或预防性使用。此外，在全身给药后，在难以到达的组织（如中枢神经系统）中充分暴露于蛋白质治疗药物以治疗不同的神经系统疾病也是具有挑战性的。尽管正在对靶向大脑的抗体进行研究，但这种方法在临床上是否可行还有待观察。例如，基因泰克为Allzhemer病开发的低亲和力抗TfR / BACE1抗体需要非常高的剂量，这在临床上可能不可行。 考虑到基于mAb的治疗药物的半衰期为2-4周和某些靶点的高周转率，实现慢性疾病的长期治疗暴露可能需要多次给药，这在成本方面可能不可行。因此，这些问题凸显了需要一种替代方法，以商业上可行的方式在作用部位提供更长的时间长的蛋白质治疗。体内基因治疗代表了这个问题的可行解决方案。该技术使用病毒或非病毒载体在靶细胞中引入遗传物质，然后靶细胞可以长时间产生感兴趣的蛋白质。 在过去几年中，多项技术进步的融合在确保这种治疗方式的进步方面发挥了至关重要的作用。许多病毒载体，如腺相关病毒（AAV）、黄病毒、甲型病毒、单纯疱疹病毒等，已被开发为在特定疾病条件下靶向不同细胞的基因递送载体。AAV基因组可以在细胞核中形成稳定的非整合性环状表体，这些外观体在非分裂细胞中持续存在，转基因表达持续数年。 因此，单次给药后持续的长期治疗效果是可行的，而没有通常与其他病毒载体一起看到的副作用，这些病毒载体将其基因组整合到宿主基因组中。虽然AAV介导的蛋白质治疗药物的基因递送也被认为是昂贵的治疗方案，但单次给药后纠正疾病可达到的长期治疗效果通常超过与治疗相关的成本。 ④血清型多，可选择性靶向不同的转染细胞，不同的组织器官
图 4.（A）不同AAV血清型与AAV受体的不同结合（B）不同AAV血清型之间VP1蛋白氨基酸组成的相对差异
AAV2是20世纪60年代从腺病毒中发现的首个AAV载体，然后将载体基因组克隆到细菌质粒。这导致了对AAV2生物学的详细了解，因此，大多数重组AAV（rAAV）载体通常利用AAV2 ITR。迄今为止，已经确定/发现了12种原发性AAV血清型和100多种不同的变异。每种血清型都具有独特的细胞向性，伴有器官生物分布和转导特性的变化。 AAV2感染最初被认为是非特异性的。然而，在1996年，Ponnazhagan等人发现了一种没有被野生型或重组AAV2载体感染的人类细胞系，这表明可能存在受体介导的摄取机制。不久之后，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）被鉴定为细胞受体，而成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）和整合素αVβ5被鉴定为AAV2的细胞共受体。其他共受体，如表皮生长因子受体（EGFR），血小板衍生生长因子受体（PDGFR），LamR（层粘连蛋白受体）等，多年来已被发现用于不同的血清型。Levy等人利用冷冻电子显微镜和三维图像重建来证明AAV2与HSPG的结合不仅允许病毒附着，而且还诱导衣壳的构象变化。因此，可以假设与主要受体的结合将病毒粒子“锁定”在过渡状态，增加其对次要受体的亲和力，从而引发内吞作用。 Pillay等人最近通过全基因组筛选发现了AAV2感染的另一种共受体，并将其称为AAVR。有趣的是，研究发现血清型与AAVR结合的特异性差异（图2A）。此外，除了少数血清型（未被研究）外，没有一个自然发生的AAV能够在AAVR敲除小鼠中转导细胞，表明AAVR可能是多种AAV血清型的共受体。表1总结了不同的AAV血清型，它们的组织趋向性以及它们定义其细胞相互作用的主要受体和共受体。 根据目前的文献，可以假设AAV与细胞表面的特异性初级受体和共受体相互作用，从而触发其内吞作用进入内体。结构改变暴露了VP1和VP2的N末端，使AAV病毒粒子从内体中释放出来并积聚在细胞的核周区域。一旦进入细胞核，AAV基因组就会被释放出来，它们的单链DNA被转化为双链DNA（dsDNA）进行转录和翻译。不同血清型衣壳氨基酸序列的差异（图2B）允许受体结合偏好的微妙变化。 表 1.不同AAV血清型以及它们相互作用的受体类型和组织趋向性
⑤宿主范围广，可转导分裂和静止期细胞 AAV被认为是体内基因转移治疗的有效递送载体，并且由于目前可用的安全性数据与其缺乏致病性，低免疫原性，已成为首选载体。与其他病毒载体递送系统相比，AAV载体的另一个优点是其广泛组织靶向性（增殖性和非增殖性细胞）。
图 5.将载体直接施用于患者体内，以便将功能矫正基因递送到宿主体内的有丝分裂后靶细胞
已经批准上市的AAV基因治疗药物 2012年，EMA批准Glybera用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD）； 2017年，FDA批准Luxturna用于治疗先天性黑蒙症（LCA）； 2019年，FDA批准Zolgensma用于治疗2岁以下脊髓性肌萎缩症（SMA）患儿。
AAV基因治疗的临床现状
根据 https://clinicaltrials.gov/，已经进行了203项利用AAV递送蛋白质基因的临床研究，69项临床试验仍在进行中，其中一些如表2所示。
表 2.正在进行的AAV基因治疗的临床试验
基因治疗的进步为许多迄今为止无法治愈的疾病有了令人振奋的治疗机会。对于使用AAV载体的基因治疗，未来十年的努力将集中在阐明和调控人类对载体的免疫反应，持续改进AAV载体的设计和开发，以精准靶向，并实现低剂量的体内疗效，从而降低AAV基因治疗的成本。
参考文献
1 Chowdhury, Ekram Ahmed et al. “Current progress and limitations of AAV mediated delivery of protein therapeutic genes and the importance of developing quantitative pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) models.”Advanced drug delivery reviews vol. 170 (2021): 214-237. doi:10.1016/j.addr.2021.01.017
2 High, K. A. & Roncarolo, M. G. Gene therapy.N. Engl. J. Med.381, 455-464 （2019）.
3 Sha, Sha et al. “Cellular pathways of recombinant adeno-associated virus production for gene therapy.” Biotechnology advancesvol. 49 (2021): 107764. doi:10.1016/j.biotechadv.2021.107764