前言
慢性阻塞性肺病 (COPD) 是一种流行的、常见的呼吸道疾病，具有显著的发病率和死亡率，已成为全球第三大死亡原因。越来越多的证据表明，肠道和肺部微生物群失调与 COPD 有关。研究表明，CD4+T 淋巴细胞的 2 种亚型辅助性T 细胞 Th17 与调节性T 细胞 Treg 比例失衡与 COPD 有关。芪白平肺胶囊 (QBPF) 是我国临床上治疗 COPD 的一种中药。然而，QBPF 干预对肠道 Th17/Treg 平衡和肠道与肺微生物群的影响仍然知之甚少。
近日，安徽中医药大学朱洁教授、李泽庚教授和复旦大学中西医结合研究所董竞成教授作为共同通讯作者，在转化医学领域权威期刊 Journal of Translational Medicine (IF：8.440) 上在线发表了题为〝The treatment of Qibai Pingfei Capsule on chronic obstructive pulmonary disease may be mediated by Th17/Treg balance and gut-lung axis microbiotan〞的研究论文，发现了 QBPF 的治疗效果是可以通过维持免疫细胞平衡和调节肠-肺轴微生物群来实现，为探索 COPD 潜在的生物标志物和 QBPF 治疗 COPD 的可能机制提供了参考。
技术路线
研究结果
1、肺功能检测及Th17 / Treg 细胞平衡分析
与对照来比，模型组大鼠体重增长缓慢，精神不活跃，毛发凌乱，色泽无光泽，背部拱起；与模型组比较，QBPF组大鼠体重及其精神状态和活动均有不同程度的改善。同时检测所有组的FEV 0.3、FVC和 (FEV 0.3 / FVC) %以反映肺功能。与对照组相比，COPD组和 QBPF 组这些指标显著降低(P < 0.01)（Fig.1）。经过QBPF 治疗后，显著改善了COPD组大鼠的各项指标，并证实 QBPF 治疗可以缓解 COPD 的症状。
通过检测外周血的 Th17 和 Treg 细胞占比情况来分析QBPF治疗引起的免疫影响。与模型组相比，对照组和治疗组的Tregs 显著增加，Th17 细胞及Th17 / Treg 均显著降低 (Fig.1) 。表明QBPF 在降低 Th17 细胞表达的同时可以增加Treg，通过降低 Th17 / Treg 来治疗COPD。
Fig. 1 | 肺功能和外周血Th17和Treg细胞的比例
大鼠血清中Th17细胞和Tregs相关细胞因子表达发生了显著变化，表明QBPF对大鼠COPD的保护作用可能是通过抑制炎症因子和调节免疫相关细胞因子(Fig. 2)。此外，Th17细胞和Tregs的转录因子RORγt和Foxp3在各组大鼠肺组织中的表达也发生了显著变化，RORγt表达显著升高，同时Foxp3 表达明显降低。(Fig. 2)。免疫组化结果表明：与对照组大鼠相比，模型组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄或断裂，弹性降低，肺泡腔扩大，部分融合成肺大疱，也有许多炎性细胞。然而值得注意的是，通过QBPF治疗明显缓解COPD肺组织病理学损害，显著降低RORγt表达，Foxp3表达则显著升高 (Fig. 2) 。
Fig.2 | 与Th17细胞和Treg细胞相关的细胞因子和转录因子
2、肠道和肺部微生物群的α和β多样性分析
为检测COPD组大鼠肠道和肺菌群的变化，以及QBPF干预能否调节菌群，对大鼠肠道内容物和支气管肺泡灌洗液 (BALF) 样本进行16SrRNA测序。对不同组别肠道内容物及BALF微生物的多样性进行分析，分析结果相似。α多样性中模型组的物种均匀度都显著低于对照组，QBPF治疗虽然增加物种均匀度但并无显著差异。β多样性分析中，PCoA图结果表明了3个组别的肠道微生物菌群明显不同，QBPF组更接近对照组 (Fig. 3) 。以上结果均表明QBPF治疗可以改善模型组大鼠肠道和肺菌群的组成结构。
Fig.3 | 肠道内容物 (A-C) 和BALF (D-F) 的微生物多样性分析
3、肠道和肺部菌群的物种组成分析
为了研究3组肠道和肺菌群群落结构的差异，分别分析了在门和属水平上各组Top15的优势菌群。肠道菌群分析表明，3组中的优势门包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门。模型组的拟杆菌门和变形菌门的占比较对照组下降，而厚壁菌门比例上升。QBPF干预后，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门的变化进一步加深。模型组Fusobacteria相对丰度较对照组降低，QBPF干预后增加 (Fig. 4)。在属水平上，相对丰度大于2%的优势属包括Prevotella_9、Lactobacillus、Prevotella_1、拟杆菌、Fusobacteria等。与对照组相比，模型组的Lactobacillus、Prevotellaceae_UCG-001、Fusobacteria表达下调，而QBPF组与模型组相比表达上调。与对照组相比，模型组Prevotella_9、Prevotella_1等水平较对照组上调，QBPF组与模型组相比下调 (Fig. 5)。
对于肺部菌群来说，Top 5的优势门是拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、Tenericutes和放线菌门占3组总丰度的92%以上。模型组中的拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和放线菌门的比例较对照下降，QBPF组则升高；模型组中Tenericutes水平上升，而QBPF组则下降 (Fig. 6)。在BALF中相对丰度超过2%的优势菌属包括支原体、Prevotella_9、拟杆菌、乳杆菌属、链球菌、鞘氨醇单胞菌和Prevotella_7。与对照组相比，在COPD模型组中，Prevotella_9、乳杆菌属、链球菌、鞘氨醇单胞菌、Prevotella_7的比例下降，而在QBPF组比例上升。与对照组相比，模型组的支原体和拟杆菌菌水平较对照组升高，而QBPF组则下降 (Fig. 7)。
Fig.4 | 肠道细菌门水平上的物种分析
Fig.5 | 肠道细菌属水平上的物种分析
Fig.6 | 肺部细菌门水平上的物种分析
Fig.7 | 肺部细菌属水平上的物种分析
4、肠道和肺部微生物群的显著差异分析及微生物群的功能预测分析
LEfSe分析来筛选出组间丰度差异显著的物种。在肠道菌群方面，与对照组相比，COPD组拟杆菌、厌氧菌、镰刀菌、Blautia、Romboutsia等较丰富。而在QBPF组中，Fusobacterium和Prevotellaceae_UCG_003丰度较高，而Fusicatenibacter、Neisseria、Acinetobacter、Mycoplasma、Blautia等 呈现出较低丰度 (Fig. 8)。
同时对肺菌群进行LEfSe分析：与对照组相比，COPD 组中克雷白杆菌、鞘氨醇单胞菌、链球菌、乳杆菌、Mucilaginibacter、Delftia、葡萄球菌、假单胞菌、Lautropia、Massilia等含量较少。而在QBPF组中，Cetobacterium、Campylobacter、Aerococcus、Acetatifactor、 Pseudomonas、Neochlamydia、Sulfuritalea等丰度较高，而Promicromonospora、Duganella、 Herbaspirillum、Glaciecola、Eisenbergiella、Negativibacillus和支原体等菌属丰度则低于COPD组 (Fig. 8)。
此外，进行了肠道菌群功能分析，KEGG功能分析结果显示：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸相关酶、氨基糖和核苷酸糖代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、核糖体和核糖体生物合成等较对照组丰富。肺微生物群KEGG功能分析表明：氨基酸相关酶、DNA复制蛋白、叶酸生物合成、甘氨酸、嘌呤代谢、核黄素代谢、核糖体等在COPD组较对照组更丰富。QBPF处理后在肠道及肺中均显著降低 (Fig. 8)。
Fig.8 | 各组间的不同属的鉴定和代谢途径的差异
5、肠道和肺部微生物菌群及免疫因子之间的相关性分析
为探讨肠道和肺部微生物菌群的关系，对肠道和肺部菌群相对丰度Top20的优势菌在属水平进行了相关性分析。在肠道和肺部中同时表达的有9个菌属，其中拟杆菌属、乳酸杆菌属等菌属呈负相关(P > 0.05)，奈瑟氏菌属、Alloprevotella等菌属呈正相关 (P > 0.05)。肺部菌群支原体与Prevotella_9 (P < 0.01)、拟杆菌(P < 0.05)呈正相关，与肠道菌群普雷沃菌科_NK3B31_组(P < 0.05)、普雷沃菌科_UCG-001(P < 0.01)、脱硫弧菌(P < 0.01)呈负相关。肠道菌群的普雷沃菌科_UCG-001与肺菌群的模糊分类群(P < 0.01)和假单胞菌(P < 0.01)呈正相关。肠道菌群的肠滴虫与肺菌群的Prevotella_9 (P < 0.01)、乳杆菌 (P < 0.01)、Rikenellaceae_RC9_gut_group (P < 0.01) 呈负相关 (Fig. 9)。
在肠道菌群和免疫因子之间识别出显著相关性。COPD 组中Lachnoclostridium、Anaerostipes、Methylophilus、Desulfovibrio、Acetatifactor等减少，与肺功能和Treg相关细胞因子呈正相关，但与Th17 / Treg和Th17相关细胞因子呈负相关。相反，在 COPD 组中富集的菌属Coprococcus_2、Rikenellaceae_RC9_gut_group、尖带杆菌、厌氧菌、Prevotella_9等与肺功能和Treg相关细胞因子呈负相关，但与Th17 / Treg和Th17相关细胞因子呈正相关。这些数据表明COPD大鼠的免疫原性状态与肺功能和肠道菌群之间存在相关性 (Fig. 9)。
在肺微生物群和免疫因子之间识别出显著相关性。在COPD组中富集的菌属Acinetobacter、Niastella、Pseudarthrobacter、Sphingomonas、Gemmatimonas、Massilia、Pseudomonas、Prevotella_2等与Th17相关细胞因子呈正相关，但与肺功能和Treg相关细胞因子呈负相关。COPD 组中丰度较低的菌属Prevotella_7、Lautropia、摩根菌等与Th17相关细胞因子和Th17 / Treg呈负相关，而与Treg相关细胞因子呈正相关。这些数据表明，COPD大鼠的免疫原性状态与肺功能和肺微生物群之间存在相关性 (Fig. 9)。
Fig.9 | 肠肺优势属相关性及关键属与相关参数的相关性热图
研究结论
本研究表明，COPD 模型大鼠中存在 Th17 / Treg 的失衡和肠道与肺部菌群的丰度、多样性和群落结构的微生态失调，用 QBPF 治疗可改善 COPD 大鼠的肺功能，促进Th17 / Treg的新平衡，同时调节肠道和肺部微生物群的组成。本研究同时为肠道和肺部菌群之间的相关性以及属水平上细菌与肺功能和免疫功能之间的相关性提供了一些证据，这些发现可能为COPD的潜在生物标志物和QBPF治疗的分子机制提供新的见解。
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