NOX4/NLRP3炎症小体通路的激活与其他器官的纤维化有关。肠道细菌失衡是肝纤维化的重要驱动因素。2021年9月，南昌大学第一附属医院朱萱课题组在Gut Microbes期刊（IF:10.245）上发表了题为“Ursolic acid reverses liver fibrosis by inhibiting NOX4/NLRP3 inflammasome pathways and bacterial dysbiosis”的研究论文，旨在探讨熊果酸（UA）抗肝纤维化作用是否与NOX4/NLRP3炎症小体通路和肠道细菌有关，为今后的治疗奠定基础。文章中的微生物多样性测序服务由我们提供。
研究背景
肝硬化的一个共同特征是潜在致病菌的增加和有益细菌的减少。肠道微生物失衡会导致细菌易位，导致炎症级联反应，肝脏损伤甚至肝纤维化。NLRP3是一种广泛参与细胞免疫的细胞内多蛋白复合物，可对有害信号作出反应，启动修复反应。之前的研究表明NLRP3炎性小体激活与卵巢、肾脏和心脏纤维化相关。NADPH氧化酶4（NOX4） 通过细胞凋亡和肝星状细胞（HSCs）激活促进肝纤维化的关键因子。然而关于NOX4/NLRP3信号通路在肝纤维化中的作用研究甚少。
肝纤维化的发生发展与肠道细菌紊乱密切相关。已有研究表明NLRP3炎性小体能够识别肠道细菌及其代谢产物，发挥肠道免疫功能，从而保护肠道。熊果酸（UA）通过抑制肝脏炎症、选择性诱导活化的造血干细胞凋亡和抑制造血干细胞增殖来减轻肝纤维化，但具体机制尚不清楚。由于NOX4和NLRP3炎性小体与许多器官纤维化的发生发展密切相关，这些因子也与肠道细菌的变化有关。因此，探索UA的抗纤维化机制是否与NOX4/NLRP3信号通路及肠道菌群调控有关，可以为今后的治疗奠定基础，对延缓肝纤维化的发展至关重要。
研究结果
1. 熊果酸（UA）逆转肝损伤、肝纤维化和细菌易位
HE染色，Masson染色和Sirius red染色结果表明，UA处理显著降低了CCl4对小鼠肝小叶结构、纤维间隔形成及胶原沉积的影响，炎症细胞浸润减少（图1a，1c，1d）。ELISA结果显示，CCl4组血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和羟脯氨酸水平较对照组来说显著提高（P< 0.050）。然而，UA处理降低了这种效果（图1b）。
图1 UA可改善CCl4诱导的肝纤维化小鼠的肝损伤和肝纤维化
免疫组化结果显示，在CCl4组的肝组织中α-SMA、Collagen-1等激活的肝星状细胞（HSCs）标志物显著高于对照组（P<0.050）。TUNEL染色结果表明，CCl4组肝细胞凋亡增加。然而，在UA组中这两种效应明显逆转（图2a）。这一结果表明，UA可以抑制HSCs的激活和肝细胞凋亡。在mRNA和蛋白水平上，CCl4组中肝纤维化相关因子（α-SMA、Collagen-1和TIMP-1）的表达在CCl4组（P<0.001）中增加，而抗纤维化因子MMP-1的表达减少（P<0.010）。UA治疗后，抗纤维化因子MMP-1的表达增加（P<0.010）（图2b-d）。这一结果表明，UA可以逆转肝纤维化。
图2 UA通过影响纤维化相关因子的表达来发挥抗纤维化作用
2. 熊果酸通过抑制NOX4和NLRP3炎症信号减轻肝纤维化
免疫组化结果显示，CCI4诱导的肝纤维化小鼠NOX4和NLRP3表达上调，UA治疗后NOX4和NLRP3表达明显（P<0.050）降低（图3a）。PCR和Western blotting（P<0.050）显示相似的结果（图3c-e）。这一发现表明肝纤维化的发展与这两个因子的表达有关。
图3 熊果酸通过抑制NOX4和NLRP3信号通路减轻CCl4诱导的肝纤维化
3. 抑制NLRP3表达可有效缓解肝纤维化
HE染色，Masson染色和Sirius red 染色结果表明，与注射CCl4的WT小鼠相比，组小鼠的胶原沉积明显减轻（P<0.001）（图4a-c）。此外，抑制NLRP3后，CCl4诱导的小鼠ALT（P<0.050）、AST（P<0.010）和羟脯氨酸（P<0.050）水平显著降低（图4d）。肝纤维化相关指标表达变化相似（图4e-g），表明NLRP3是肝纤维化过程中重要的促纤维化因子。与组相比，+UA组胶原沉积和纤维间隔形成变化不明显。血清指标和肝纤维化相关因素的变化也不明显（图4a-g）。在+UA小鼠中，与CCl4组相比，NOX4的mRNA和蛋白表达均降低（P<0.050）（图4h-j）。
图4 UA对 小鼠NLRP3炎症小体表达的影响
4. 抑制NOX4表达可有效缓解肝纤维化
与肝纤维化WT小鼠相比，+CCl4和CCl4+AP组小鼠的胶原沉积较少（P<0.050）（图5a-c）。同样，谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和羟脯氨酸水平也低于WT小鼠（图5d），表明抑制NOX4可显著恢复肝功能。相关纤维化因子的表达也表明NOX4在肝纤维化的发生发展中起重要作用（图5e-g）。这些结果表明，抑制NOX4可以改善肝纤维化，并且NOX4是一种重要的促肝纤维化因子。HE染色, Masson染色和Sirius red染色结果显示，与+CCl4组和CCl4+AP组比较，NOX4组胶原沉积和纤维间隔形成无明显差异，但仍低于WT组（P<0.010）（图5a-c）。同样，UA治疗后血清肝功能损害指标也有一定程度的恢复，促纤维化因子表达下调，抗纤维化因子表达上调（图5d-g）。
图5 UA对小鼠NLRP3表达的影响
5. NOX4有效刺激了NLRP3表达
+CCl4小鼠与WT+CCl4小鼠相比，NOX4的mRNA和蛋白表达均无明显降低（P>0.050）（图4h-j）。所有小鼠的NLRP3的mRNA和蛋白水平均显著低于WT+CCl4组（P<0.010）（图5h-j）。这表明，NOX4可能是NLRP3的上游信号。
6. 微生物丰度多样性的比较
检测了四组的α多样性指标（Chao1指数、Shannon指数），以了解肠道微生物多样性（图6a，b）（P<0.050）。CCl4组的多样性显著低于对照组，而组和组的多样性显著高于CCl4组。分析β多样性进一步评估各组之间肠道结构的差异（图6c，d）。PCoA图和NMDS分析显示，对照组、CCl4组、组和组的肠道结构存在差异，微生物种类的丰度也不同（图6e）。
图6 四组CCl4致肝纤维化小鼠肠道微生物多样性的变化
7. 微生物丰度组成的比较
在微生物丰度方面，门水平（图7a-c）上，在CCl4组有益细菌的丰度低于对照组（P<0.001）。组和组丰度显著增加（P<0.001）。而有害细菌变形杆菌则表现出相反的趋势（P<0.050）。在种水平上（图7d-i），与对照组相比，CCl4组小鼠肠道微生物群中携带了更多的菌（P<0.001）和更少的有益乳杆菌（P<0.010）。与CCl4组相比，组和组的变化趋势完全相反。
图7 四组CCl4致肝纤维化小鼠的微生物丰度
8. 肠道结构与环境因素的关系
有益菌乳酸菌和有害菌与肝功能指标（AST、ALT、羟脯氨酸）相关，有害菌与这三项指标呈正相关。这一结果表明，肠道中有害菌的丰度随着肝功能损害的增加而增加。抑制NOX4/NLRP3炎症体信号通路可以减少有害菌的数量，增加有益菌的数量。UA通过NOX4/NLRP3炎症小体途径改善肠道结构。
图8 肝纤维化小鼠中微生物丰度与AST、ALT和羟脯氨酸之间的潜在联系
研究结论
本研究表明，NOX4/NLRP3炎性小体信号通路在肝纤维化的发生发展中具有重要作用，是肠道细菌调控的重要靶点。UA通过该信号通路发挥抗纤维化作用，NOX4/NLRP3炎性小体是治疗慢性肝病的关键抗纤维化靶点。
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