前言
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。基于质谱的定量蛋白质组学是研究全球蛋白质丰度的一种非常适合和广泛使用的分析工具。
StevenA.Carr麻省理工学院和哈佛大学博德研究所在Mol. Cell. Proteomics期刊发表的题为“Streamlined Protocol for Deep Proteomic Profiling of FAC-sorted Cells and Its Application to Freshly Isolated Murine Immune Cells”（IF：7.3）的文章，该研究已经开发出来一种简化且易于获取的样品制备方案，能够直接从流式细胞仪上获得相对数量较少的基于TMT的小鼠免疫细胞的蛋白质组学分析，深度超过7000个定量蛋白。这些数据概括了免疫学的许多方面，提出了新的细胞类型特异性蛋白标记，并为整个免疫系统的基因表达转录后调控提供了证据。
研究背景
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。基于质谱的定量蛋白质组学是研究全球蛋白质丰度的一种非常适合和广泛使用的分析工具。
典型的蛋白质组学工作流程通常受到深度定量蛋白质组学分析所需的样本输入量的限制。为了满足这一需求，该所开发了一种易于实现的、精简的工作流程，可以从每个实验条件下大约2 μg的蛋白质输入量中进行定量蛋白质组分析。
研究思路
研究结果
1、低输入蛋白质组学样品制备方法的研究进展
实验开发的简易的收集微反应器，可以有效地捕获和洗涤FACs分选细胞，并对少量细胞进行裂解和消化，然后，可以将消化液直接转移到反应器。为了将收集微反应器与标准离心管进行比较，研究员将初级B细胞直接分装到试管和反应器，并比较这两种方法鉴定的多肽数量。收集微反应器在单次扫描、无标记LC-MS/MS模式下识别不同肽段的表现优于试管，并且具有更大的总离子电流(TIC)。
通过对低输入样本进行多路复用，结合多个实验的信号，提高了MS1信号强度，提高了数据采集的整体灵敏度。实验测试了柱上TMT标记能产生更高比例的标记多肽，比标准方案的重复性更强(图3A)。与溶液内标记相比，柱上标记方法的肽段图谱匹配(PSMs)也增加了27%(图3B)。
最后，柱上TMT标记避免了额外的脱盐步骤，并将整个标记方案从大约3小时减少到10分钟以内(图3C)。这些结果表明，柱上TMT标记策略对低微克水平的多肽标记更快、更有效。
2、FACs分选免疫细胞的深度定量蛋白质组学分析
通过对比SCX 、bC18、bSDB三种方法可以发现，分选提高了TMT标记肽段的数量(图4A)。bSDB分馏在PSM数量上优于bC18分馏，在之后的馏分中鉴定出的分析物具有更高的前驱体强度，且馏分的肽段唯一性更强(图4A-4C)。将bC18和bSDB各自的步骤馏分中鉴定的肽段的保留时间(RT)与未分馏样品的RT进行比较，结果显示肽段在bSDB馏分中的分布更加均匀(图4D)，这些数据表明，bSDB是一种正交的，非常适合于分离少量TMT标记肽的方法。
3、差异丰富和免疫细胞类型特异性蛋白的鉴定
蛋白的原始数据先进行删除缺失值再进行归一化处理，然后取差异表达的前20个差异蛋白:即取一种细胞类型中与其他细胞类型相比最大的20倍变化值，计算出Top 20个差异表达基因。对蛋白质差异倍数作图，经过调节F检验，根据样本两两间的Pearson进行相关性聚类。又经过主成分分析(PCA)对前13%的蛋白质进行任意截点，F统计量最高(FC值高，精度高)。15%是Immgen相关研究中常用到的阈值。通过基因集富集分析(GSEA)对PC1和PC2的基因集进行分析，从而验证通路驱动的转录与蛋白的关系。
4、蛋白质/RNA关系揭示了整个免疫系统转录后调控的证据
为了分析协同调控，分析计算了所有成对mRNA、蛋白之间的欧氏距离并聚类。为了在蛋白质水平上观察到mRNA共同调控之间的差异，按mRNA聚类的顺序绘制了蛋白质不同细胞类型的相关性。通过对每种细胞类型的每种基因产物的表达水平进行排名，计算表达等级。跟据Delta-rank分析计算了每个细胞的每个基因产物的Delta-rank值。通过计算和聚类重叠测量的5125个基因产物的ρ值来寻找mRNA和蛋白质的共同调控。mRNA和蛋白数据均显示出各自不同的富集通路和共同富集的通路，提示本研究中不同免疫细胞类型之间存在共调控(图7B-7C)。
按照mRNA数据的聚类顺序重新排列蛋白质数据，发现数据结构明显缺失和非对角相关性(图7D)，这表明初级小鼠免疫细胞对所需的蛋白质格局显示出一定程度的转录共调控缓冲。通过GSEA分析，将这些基因集的基因产物进行组合并用于下游的分析。对单个细胞类型的TLR基因集中的delta-rank基因产物水平进行聚类分析。在RNA水平相对较低、蛋白质水平较高的细胞类型中，基因产物将具有一个较大的表达。（图7F）
研究结论
实验将低输入蛋白质组样品制备方法应用于根据Immgen协议分类的12种新鲜分离的小鼠免疫细胞类型。据悉这项研究首次提供了来自其常驻组织而非外周血的主要免疫细胞类型的蛋白质组特性。从小鼠重复之间的高重复召回率可以看出，超过7000个蛋白质的高重复性被定量。
本次研究的低输入蛋白质组学将以往方法的适用性扩展到FACs分类的免疫细胞，并强调了减少处理样品制备的价值，特别是那些需要分析有限数量的样品。后续希望这些方法将使研究人员能够对以前无法获得的稀缺样本进行蛋白质组学实验。
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