前言
淋巴瘤和白血病是儿童中最常见的癌症类型，随着疾病预测与治疗的进步，这些造血系统肿瘤诊断分类的复杂性增加。目前的血液病理学家多用光学显微镜和免疫表型研究（流式细胞术/免疫组化）进行诊断，但形态相似或者重叠的细胞不能以这种方式进行区分。应用流式细胞术，用针对细胞类型特异性标记物的荧光标记抗体进行染色。确定每个标记存在与否，通过标记的免疫表型鉴定其细胞类型，但会受到测试所选抗体的限制，无法区分相似免疫表型的细胞，这种情况需要借助显微镜来做。因此单独使用显微镜或流式细胞测量法，都不足以做相对准确的诊断。
本篇来自于美国斯坦福大学Sean C. Bendall团队在Nature Medicine（IF：87.241）发表了题为“Multiplexed Single Cell Morphometry for Hematopathology Diagnostics”的研究成果，通过CyTOF质谱流式细胞技术（单细胞蛋白质组学），将形态测量法与免疫分型相结合，融合为一种高通量、高度复用的单细胞测定法。既可用于传统的细胞测量，也可用于新的诊断参考，该方法或可起到优化常规的血液病理学自动化诊断的作用。
研究背景
由于将形态学和免疫表型结合可以提高诊断能力，因此建立一种形态计量学的方法，使细胞检测流程中能间接看到显微镜下的特征变化是十分有必要的。随着疾病和样本类型特定的分析方法需要，需要一种可自动化的方法。像质谱流式细胞术（CyTOF）的方法，因为有高度复用性和定量动态范围广的特点，有望满足需求。
质谱仪可使用重金属同位素偶联物取代荧光基团，在单个细胞上同时量化40多种抗原，在一天内可实现对数百万个细胞的量化，同时实现系统化和自动化的分析。样本复用——可同时处理和运行多个样本，允许分批进行，这样也可以降低成本。
本研究确定了一组细胞抗原，对来自健康人骨髓的细胞进行了表征研究，与来自不同疾病的骨髓和血液样本的细胞进行比对，通过单细胞形态测量定义了正常和肿瘤群体。这些工作能够追踪健康和恶性造血分化的连续过程，形成靶向细胞计数的基础，或可应用于当前的临床实验室流程中。
研究思路
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研究结果
1、散射体量化了造血细胞的不同结构特征
为了通过形态计量学捕捉光学显微镜评估的细胞形态，研究人员分析了人造血细胞共有的多种类型，选择了11个形态计量学指标(图1A-B)，这些结构特征在与诊断相关的造血细胞群体-粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、有核红系前体细胞和造血母细胞(图1D)之间存在定量差异。这些特征的复合单细胞分析通过计算能把结果组合为二维的“形态测量图”(图1E)。质谱流式CyTOF单细胞蛋白质组学将揭示其免疫细胞类型组成和异常细胞类型(图1F)，将形态计量学与标准免疫表型表征相结合。仅使用形态测量法和CD45，t-SNE能成功地分离形态不同的种群。重要的是，没有分离形态上没区别的B细胞和T细胞。因此，形态计量学分析定量捕获足够形态特征对主要细胞类型进行分类。
图1 | 散射体捕捉了健康人骨髓中主要造血细胞群体的形态差异
2、不同临床患者样本单细胞形态学特征具有相似性
研究者选择了54个不同血液系统肿瘤的临床样本，包括AML、ALL、MDS、MPN、B和T细胞，使用CD抗体定义这些样本群体，比较它们的形态特征，正常细胞的形态学特征具有高度一致性。为了说明肿瘤多样性和潜在的形态学原理，选择了11个样本进行热图分析（图2A-G）。研究表明来自淋巴白血病的原始细胞显示出更多的淋巴细胞模式，而来自髓性白血病的原始细胞则显示出更多的骨髓特征（图2D）。
为定量地验证这些模式，对患者细胞群之间形态学特征进行了相关性分析，并进行层次聚类（图2H）。研究发现来自不同患者的相同细胞类型的形态学特征高度相关。但其CD抗体表达差异很大。总体来说，即使在疾病样本中，形态计量学也可以识别出细胞类型特异性标志物。
图2 | 不同临床患者样本的形态特征具有一致性
3、个体形态特征具有独特的诊断能力
评估了主要细胞类型的整体形态测量后，各形态显示出对诊断有用的特征。该研究发现对正常/反应性外周血，骨髓和淋巴结T细胞表达一种核纤层蛋白A/C，研究人员推测肿瘤群可能表现出更多的核纤层蛋白A/C。在进一步研究中5种成熟T细胞淋巴瘤均表达核纤层蛋白A/C，且与T-ALL原始细胞和正常T细胞相比，核纤层蛋白A/C高表达（图3A-B）。研究表明，核纤层蛋白A/C也有助于区分标准临床流式细胞术无法区分的T未成熟淋巴细胞白血病(T-PLL)和T淋巴细胞白血病(T-ALL)。
临床研究上多以CD34和CD117标记鉴定肿瘤母细胞，但两者也在肥大细胞、红系和血小板前体细胞上表达。因此这两种标记不适用于所有白血病的检测（图3D）。研究人员寻找一个与大多数原始细胞所具有的形态上“精细”的核染色质相关的标记物——在39个样本中，正常和肿瘤原始细胞始终高表达的核纤层蛋白B1(图3E)。鉴于白血病的免疫表型和谱系的多样性，这种单细胞形态计量学方法结合核纤层蛋白B1的定量，代表了迄今为止最一致的原始细胞识别符。此外研究中发现rRNA的丢失或许可作为一个单一抗原的“伪时间”轴，能够跟踪细胞沿多个谱系的发展。结合VAMP-7，能在健康的骨髓样本中观察原始细胞向髓系和淋巴样细胞的演变(图3F)。以上说明了形态计量学可以提供对多个细胞谱系的诊断。
4、VAMP-7是在未知血液系统恶性肿瘤分类的替代方法
SSC（侧向散射）主要来源于光对细胞内颗粒的垂直反射，VAMP-7是主要功能成分。在最初研究的54个临床样本中，分析发现VAMP-7与CD45的关系和SSC与CD45的关系高度相似（图3G-H）。因此对它是否可以成为非荧光细胞术诊断工作流程的有效替代方案存疑。为了证明这点，研究人员选择了11个样本进行了相似的处理。研究发现在流式细胞术和质谱流式单细胞蛋白质组学在诊断上是等效的——即捕获了相同的亚群，免疫表型特征相似，可用于相同的疾病诊断。且流式细胞术和形态计量细胞学的结果高度相关（R2=0.84，p<10-190）。因此，VAMP-7可以作为SSC的替代物用于大规模细胞计数中。
图3 | FRA 对胆汁酸转运蛋白和 JNK/p53 通路成分表达水平的影响
5、用于最佳种群识别的多参数形态测量图
虽然VAMP-7可以概括SSC用于实验室诊断，但研究人员想要生成新的二维可视化图来整合细胞形态测量的多个维度。为了确定SSC与CD45或VAMP-7与CD45的关系，研究人员用线性判别分析（LDA）生成形态测量图（图4A-B）。将形态计量图(MM)的群体、SSC与CD45、VAMP-7与CD45的群体进行比较。研究发现MM门控在四个人群中表现与SSC和VAMP-7的更相似，纯度更高，特别是胚胎细胞和单核细胞（图4C-E）。证实了将来自多个单细胞结构特征的信息组合到新的形态测量轴上的方法改进了传统的基于光散射的形态评估。
图4 | 形态测量图对SSC与CD45门控进行改进
6、对比正常的粒细胞和骨髓发育不良的髓系形态计量图
形态计量学线性判别分析（LDA）也适合连续的分化过程。研究人员从健康对照样本中分离单核细胞、原始细胞和成熟中性粒细胞的单细胞，建立了乳铁蛋白、核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白B1、溶菌酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂B1、VAMP-7和CD45髓系分化轴（图5A），进一步确定髓系分化轴能否可视化分化过程。根据标记CD34、CD13、CD15和CD16进行了中性粒细胞分化的五种阶段（原始细胞→早幼粒细胞→髓细胞→间髓细胞→中性粒细胞）在髓系分化轴上的定位（图5B）。表明这种髓系分化轴无需使用表面标记就以可视化粒细胞。
7、用形态计量图量化髓系白血病中成熟胚胎细胞
为标准化散射体染色变异性，研究人员训练新的原始细胞分化轴，以最佳地分离三个健康骨髓样本的单核细胞、中性粒细胞和原始细胞。在rRNA和BD2上绘制髓系细胞图(图5D)，模型图左上角为原始细胞，向右下角成熟为中性粒细胞，向右方向成熟为单核细胞。研究发现正常单核细胞的rRNA水平与背景成熟的粒细胞相似或更低(图5D，绿色箭头)。此外，典型的白血病原始细胞向正常原始细胞的左上角移动(图5D，AML 9)，而单核细胞原始细胞向右上移动(图5D，AML 7)。研究进一步证明了如何使用有监督的机器学习，针对特定的诊断问题定制多用途形态测量标记的新组合，并且优于标准的免疫表型和光学显微镜技术，从而提高血液病的诊断能力。
图5 | 与CD45相比，形态计量图可以概括并改善侧面散射
研究讨论
在本研究结果中，研究人员研究了不同血液病肿瘤类型的临床样本，单细胞形态测量定义了正常和肿瘤群体。研究发现核纤层蛋白B1有助于区分急性白血病，核纤层蛋白A/C有助于区分正常和肿瘤的成熟T淋巴细胞，VAMP-7 概括了光细胞仪侧向散射。结合有监督的机器学习，形成了正常和肿瘤细胞分布和分化的直观可视化，这种方法优于流式细胞术和光学显微镜技术，能够提高造血系统疾病诊断的自动化能力。
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为探究造血系统肿瘤疾病诊断的准确性，该研究通过质谱流式细胞技术单细胞蛋白质组学，将形态测量法与免疫分型相结合，融合为一种单细胞测定法。可起到优化常规的血液病理学自动化诊断的作用，在一定程度上为提高临床造血系统疾病诊断准确性提供方法参考。
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