《霸王别姬》的故事讲的是中国民国时期到中国改革开放期间，段小楼和程蝶衣两个戏子之间跨越半个世纪的感情纠葛。
段小楼和程蝶衣都是艺名，他们两个是剧组的台柱子，分别担任生角和旦角，在他们的拿手好戏《霸王别姬》里，段小楼唱霸王，程蝶衣唱虞姬。
故事从他们两个人学艺时讲起。那时段小楼还不叫段小楼，叫小石头；程蝶衣也不叫程蝶衣，叫小豆子。小豆子是新来的，长得眉清目秀，胆子小。大师哥小石头颇有侠义风范，处处关照这个日渐依赖自己的师弟小豆子。日子一天天过去，在生活的赤贫中，在艰苦严苛的训练中，在挣口饭吃的卖艺表演中，在关师傅严打怒骂和师兄弟的打闹中小石头和小豆子建立起深厚的友谊，小豆子越来越依恋起自己的师兄小石头。
分角后，小豆子唱旦角，他渐渐迷失在自己的性别里，他不知道自己到底是女娇娥还是男儿身了。
弹指一挥间，段小楼和程蝶衣与关师傅签订的十年学艺合同到期，他们已经历练得能独挡一面，和师兄弟们组成剧组演出，而对徒弟们即粗鲁又有关爱的关师傅转身又去收徒了。
正当程蝶衣以为一辈子就这样和师兄相亲相爱唱下去的时候，段小楼却和妓女菊仙好上了，两个人随后又成了亲。
这使程蝶衣难以承受，他以惩罚自己使段小楼难受的方式染上了大烟瘾。程蝶衣特别希望菊仙能离开段小楼，菊仙虽懂程蝶衣的意思，但她也是深爱段小楼的，怎肯离开！菊仙也是多次提醒陈蝶衣是男儿身，应该自己成家不该感情上依赖段小楼。
他们从民国时期又经历了抗日、内战、新中国成立、文化大革命，遭受了各个历史时期对他们的冲击。
最为残酷的时期就是文化大革命时期，在造反派的威逼下，师兄二人相互揭发“罪行”。在不正常的年代，人在肉体和精神双重折磨下，人性似乎也不可避免地扭曲了。段小楼指责程蝶衣是汉奸，为日本人唱过戏，那可是程蝶衣为了救段小楼所为啊！当然这里面也有一个交易，那就是程蝶衣救段小楼，但是菊仙要离开段小楼。可菊仙失言使程蝶衣觉得自己被愚弄。而如今段小楼却指责他，程蝶衣愤怒之下也举报了段小楼一些“反革命”事件，菊仙本来想阻拦段他们兄弟相残可为时已晚。疯狂的程蝶衣指出：菊仙是婊子，是娼妓。说出来之后所有人都震惊了，包括程蝶衣自己。为了保护菊仙，让菊仙和自己划清界限，段小楼说出自己嫌弃婊子的话，伤了菊仙的心，菊仙就此在家里上吊自杀了。
之后，段小楼和程蝶衣分别被发配南蛮之地和丝绸之路的途径之处，在粉碎四人帮之前的两年，段小楼又偷渡香港。就在两个人以为再也见不着的时候，偶然段小楼在街头看见贴着的大字报，“程蝶衣”三个大字赫然入目，原来程蝶衣在四人帮粉碎后，得到平反，这次是带着年轻一代的文娱戏曲演员来演出的。
时过境迁，当两个身体起皱的老人在德聚堂的大澡堂子泡澡，心中的酸甜苦辣各种滋味难以诉说，他们互相介绍了分别之后自己的生活，又不可避免地碰触到那件事。
段小楼毕竟爱过菊仙，菊仙也是真的爱过段小楼，他让程蝶衣帮忙在内地找到菊仙的骨灰给他邮寄过来。对程蝶衣来说，这不是帮忙不帮忙的事，而是他们三个人感情倾斜的事，相逢的喜悦瞬间从程蝶衣的心头消失，又一次从头凉到了脚。
在乎了一辈子的大师兄，他都感觉不到自己的感情吗！
不！段小楼怎么能感觉不到，只不过他是一个世俗之人，不肯接受这份感情而已。
他又对程蝶衣强调了一句，“我和她的事都过去了......”这句话反映出段小楼是知道程蝶衣对他的感情的，要不怎么会强调他和菊仙是“过去了”呢！
段小楼对程蝶衣感情太复杂，既有兄弟情，又有深乎兄弟情的那份感情。如果他和菊仙都掉水里了，救谁？还真会难坏了段小楼！
师兄二人在分离多年后，在只有他们两个人的香港的舞台上最后一次合演《霸王别姬》——尽管他们是那么老，段小楼在文革中早已坏了嗓子。
电影中程蝶衣假戏真做拔剑自刎，在师兄小楼的怀中结束了自己的演艺生涯。在小说中，程蝶衣回内地去了。——因为组织上的照顾，他已经娶了妻！